柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸
［］ ．ｅ ｇＧ Ｊ ｕｈ ，． ａ Ｗｉｉ ｅ，．． ｉ ２ Ｃ Ｄ Ｊ ，． Ｈ ｇｅ ＥＶｎ ｒｇ Ｋ ＪＷｌ ｏ ｎ ． ｓ ｅｎ ｎ －
ｓｎＪＣ ｒｍ ｔｇ．２１３５１８） ｏ ， ｈｏ ａ ｒ，４ ，４（９２． ． ｏ ［］ ． ． ｉ ｉ ｓ ａ ，Ａ ｖｎｅ ｉ Ｃ ｒｍ ｔ ｒｐｙ ， ３ ＪＣ Ｇｄ ｎ ｅ ｌ ｄ ｇ ｔ ． ｄａｃ ｎ ｏ ａｏ ａｈ ｓ ｈ ｇ
氨基酸不稳定， 特别是甘 氨酸、 赖氨酸衍生物的信号 衰减很快， 此法多用于全自动的在线衍生（ｎｌｅ。 ｏ－ｎ） ｉ ４Ｏ Ａ法分析配合饲料氨基酸回收率较低， ．Ｐ 这可能 是配合饲料中的盐分影响了衍生（） ０ ｌ。
一、 邻苯二甲醛 Ｏ Ａ） Ｐ 法
邻苯二甲醛（Ｐ 衍生法， Ｏ Ａ） 早在１７年就由 ９１ Ｒ ｔ 提出， ｏｈ 由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍， 故
Ａ － Ｈ ＋Ｄ ｎｙ Ｃ Ａ Ｎ － ａｓ －ｌ Ｃ Ａ Ｎ ２ ａｓｌ ｌ Ａ Ｈ Ｄ ｎｙ Ｃ＋Ｈ ｌ ｌ
从仪器设备上讲， 均采用两元梯度淋洗， 需要两 台高压液相色谱泵， 紫外或荧光检测器等。 分析柱多 采用反相Ｃ８ Ｆ Ｃ法以反相Ｃ柱居多。 １ ＭＯ 柱， ８ 从仪器 生产厂家看， 惠普公司和吉尔森公司采用 Ｏ Ａ与 Ｐ Ｆ Ｃ结合法（ ， ｔｓ ＭＯ ２ Ｗａ ｒ公司则建议采用 ＰＴ ５ ） ｅ ＩＣ 法， 并推出了专用的氨基酸分析柱Ｐｃ－ａ 及衍生 ｉ Ｔｇ ｏ 工作站，Ｋ Ｌ Ｂ公司则认为 Ｏ Ａ Ｆ Ｃ和 ＰＴ Ｐ ＭＯ ＩＣ三 法均可使用。 在实际应用中，Ｐ Ｏ Ａ和Ｆ Ｃ在生理 ＭＯ 体液中应用较多， 而在食品和饲料工业中ＰＴ ＩＣ法 占主导地位。 据Ｆｒ 统计结果表明， ｓ ｔ 每年采用Ｏ Ａ Ｐ 法大约分析８０个生理体液样品，ＭＯ ＩＣ和 ００ Ｆ ＣＰＴ
最初作 为 一种柱后 衍 生剂 ， 来才作 为柱 前衍 生剂 后
二、 氯甲酸药甲醋（ 药基 ９ － 甲氧基狱酞氯，ＭＯ ） Ｆ Ｃ
氯 甲酸药 甲 酯 ナ 是多 肽合成 的氨基保 护剂 。 它能
使用 Ｊｎｓ ７ ｏｅ等（提出的衍生方法如 下 ） ：
Ｏ Ａ在２巯基乙醇存在下与第一级氨基酸迅 Ｐ － 速反应生成１硫代－ 烷基异叫哚（， － ２ － ８ 加成物可产生 ）
化和样品制备条件下， 最多只能分析１０ ＩＣ样 ５个Ｐ Ｔ
品， 可能是 由于存在痕量的 ＰＴ 这 ＩＣ衍 生剂造成 的。
四、 丹酰氯（ 二甲氨基萘磺酰氯 Ｄ ｎｙ－ｌ ａｓｌ ） Ｃ
ＤｎｙＣ 原是检测一、 ａｓｌ ｌ － 二级氨基酸的著名荧光 剂， 生成氨基酸衍生物可用反相液相色谱分离（， ２２ ２３ ） 衍生是按照Ｔｐｈ（） ａｕｉ４ ２提出的方法进行的：
Ｖｏ． ２ Ｍａｃｌ ｋ ｅ Ｉｃ ， ｗ ｒ ， ． ７ １ ８． ｌ２ ， ｒｅ Ｄｅｋ ｒ ．Ｎｅ Ｙｏｋ Ｐ ３ ， ９３ ｎ
［ Ｇ Ｍ Ｃｕ ， Ｔ Ｆａ ｅ ｅ ｅ，．Ｊ ｉＣ ｒ ４ ． ｃｌ ｇＷ．．ｒ ｋｎ ｒ ｒ ｒ， Ｌ ．ｈｏ ］ ｎ ｎ ｂｇ Ｊ ． ｑ
ｍ ｔ ｒ，１３ ，１ （９８． ａ ｇ．１ （）６３１８） ｏ ［］ ． ｒ ，．ｏａｋ ａ ，． ｈｏ ａｏｒ，９ ，５ ５ Ｐ Ｆ ｓ Ｌ Ｐｌｃ ｅ ｌ ＪＣ ｒｍ ｔ ．４９５７ ｔ ｌ ｔ ． ｇ
邻 苯二甲醛 （ Ｐ ） 、 甲酸 药甲酯 （ 叫９芴基 甲 Ｏ Ａ法 氯 或 － 氧 基羰酰 氯 Ｆ Ｃ 法 、 ＭＯ 异硫氰酸 苯酯 （Ｉ Ｃ 法和 ＰＴ ）
Ｏ Ａ法最大缺点是：． Ｐ １不能与带有仲氨基团的 脯氨酸或羟脯氨酸反应， 歉 因此做全谱分析时需配以 其它技术（ 如与Ｆ Ｃ衍生剂一起使用） ． ＭＯ 赖氨酸
（９ ０ ． １９ ）
［］ Ｒ ｔ ，ｎｌ ｈｍ．４ ，８（９１． ６ Ｍ． ｏ Ａ ａ Ｃ ｅ ，３８０１７） ｈ ．
ＰＴ ＩＣ作为柱前衍生试剂， 它可以和一、 二级氨
基酸反应 ， 在室温下仅十分钟即可完成 ， 反应产物在
基 酸结构 稳定 ， 在室温 下放置数 小时、 冰箱 中放 置数
周后分析， 都可得到良好的结果。 是采用ＰＴ 图４ ＩＣ
衍 生法 分析蛋 白水解液色谱 图。
原来氨基酸结构上引入苯环产生紫外吸收， 使得能 够用紫外检测器（５ｎ 检测一 般说来，ＩＣ氨 ２４ｍ） ＰＴ －
三、 异硫氢酸苯酯（ＩＣ ＰＴ ）
作为Ｅ ｍ ｎ 试剂 ＰＴ ｄ ａ（ ） ＩＣ最初广泛用于多肽及 蛋白质序列分析，９２ ｏｐ１提出用ＰＴ （ｄ １８年Ｋ ｏ［］ ６ ＩＣＥ － ｍ ｎ试剂） ａ 分析氨基酸，ｅ ｒｏ［ 和Ｂｄｎｍｙ Ｈ ｉｉ ｎ ］ ｉｉ ｅ－ ｎｋ ｌｇ ｅ［］ ｒ８ １完善了方法的衍生步骤， 反应如下：
Ｃ Ｏ Ａ。 ｌ Ｐ
不能给出高的灵敏度， 检测极限为５ｐ ｏ， ０ｍ ｌ仅为 Ｏ Ａ法和 Ｆ Ｃ法的１５ ． Ｐ ＭＯ ／０３值得注意的是使用 ＰＴ ＩＣ易于降低柱寿命， ｓ等人提出在有保护柱 Ｆｒ ｔ
情况下， 根色谱柱可令人满意地分析８０ ＭＯ 、 一 ０Ｆ Ｃ
７０ Ａ和５０ ｓｌ ｌ而尽管在严格的真空净 ０Ｏ Ｐ ０ ＤｎｙＣ， ａ －
ＰＴ ＩＣ柱前衍生反相Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ法有很好的分辨率 和较短的分析时间， 但最初的一些报道指出ＰＴ ＩＣ 方法的再现性低于茚三酮法， 如果样品存在非挥发 性盐类和洗涤剂， 都会使结果受到影响（ ， ９尤其对 天门冬氨酸、 谷氨酸、 组氨酸和赖氨酸影响最大。 但
最 近 几年 研 究 已经 证 明 ＰＴ ＩＣ方 法准 确 性 可 以和
技 术的发展， 为氨基酸分析提供了广阔的前景 。 目
前不少方法已趋于成熟， 并且逐步被临床化学、 蛋白 质化学、 生理研究以及食品、 饲料营养分析者所认可 与 采用。 这些方法大多具有衍生操作简洁， 哂 徊产生或 易于排除干扰物、 色谱分离分辨率高， 灵敏度高， 分
析时间短 以及仪器 简单 、 一机 多用等优点 。 也可 但也
变异系数一般为２ ．％ （Ｖ ， －３４ Ｃ ） 生理体液为４ ７ 手动衍生ｏ－ｎ）酪氨酸和组氨酸的大些， ％（ ｆｌｅ ｆｉ 为 ８ ０ 表１ －１％ 给出了Ｏ Ａ等方法测定结果与理论值 Ｐ
的 比较 。
有各自的欠缺与不足。 本文就是根据我们的经验及 有关的文献［ ］对 前应用最广、 ４， ５ 影响最大的几种 柱前衍生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法— —
的荧光， 一般需在上机前萃取净化。 最近Ｂｔ ｒ４ ｅ ｅ１ ｎ（ ）
提出采用１ － 氨基金刚烷（Ｄ Ｍ） Ａ Ａ 与过量Ｆ Ｃ试 ＭＯ
剂反应 ， 生成衍 生物 可在全部 氨基 酸衍生物 之后 出 峰 ， 就排除 了试剂 峰的 干扰 。 技术 的应用 ， 这 该 无疑 使该法衍生步骤 简化 ， 且易于实现在线 自 动化 。
ＩＥ法相媲美。 Ｃ 现今ＰＴ ＩＣ衍生法已广泛应用于生
物 、 及 分析 （１ 材料 饲料 食品 中０） ２。 ， ２
ＰＴ ＩＣ法分析蛋白水解液中氨基酸的变异系数 一般为２ －４ ， 生理体液为３ ％ －５ 但组氨酸和胱氨
酸稍大， 分别为６ ％和１％。 给出ＰＴ ０ 表１ ＩＣ法与 值及ＩＥ方法的结果比较。 Ｃ 但是该方法也具有三个劣势：． １氨基酸衍生时 需要真空干燥以除去过量试剂， 使得ＰＴ ＩＣ法很难
Ｄ ｎｙ Ｃ 法 则为５０－６０个 。 ａｓｌ ｌ － ００ ００ 参考文 献 ［］ ． ｏ ，． ．ｐ ｋ ａ， Ｈ Ｓ ｉ Ａ ａＣｅ ． １ ＳＭｏ ｅＤＨ Ｓａ ｍ ｎＷ． ．ｔｎ ｎｌ ｈｍ ， ｒ ｃ ｅ， ．
３ ， １５ ９ ８ ． ０ １８ ５）
ＤｎｙＣ 衍生方法比较简单， ａｓｌ ｌ － 尽管一些报道说 衍生物产率决定于 ＤｎｙＣ 与氨基酸比例， ａｓｌ ｌ － 但经 Ｔｐｈ等改变一些条件后， ａｕｉ 解决了这一问题， 最适 合的比例一般为５１ ０１ ：－１：。 ＤｎｙＣ 与氨基酸反应时间比较重要， ａｓｌ ｌ － 在室温 及避光条件下需３分钟左右。 ５ 反应产物转化率与反 应时间关系很大， 而且温度升高可以加速产物转化， 但最高不可超过６ ， ０ 否则Ｄ ｎｙＣ 会发生水解， ａｓｌ ｌ － 反而使产物转化率降低。 为ＤｎｙＣ 法测定氨 图５ ａｓｌ ｌ － 基酸的标准色谱图。 给出了ＤｎｙＣ 法测定结 表１ ａｓｌ ｌ － 果与离子色谱法比较。
干扰分离与检测， 不必除去过量试剂， 色谱图基线也 比较平稳。 为Ｏ Ａ衍生法测定蛋白水解液的色 图１ Ｐ
谱图。
Ｏ Ａ柱前衍生反相ＨＰＣ法比传统柱后衍生 Ｐ Ｌ 有更高的分辨率和灵敏度（ ９ ）多数氨基酸检测极限 为０５ｍ ｌ以信噪比２５１ ， ．ｐ ｏ（ ．：计）只有组氨酸和赖氨
酸较 高， 别 为２５ ３５ｍ ｌ Ｐ 法蛋 白水 解液 分 ． 和 ．ｐ ｏ Ｏ Ａ
与带有伯、 仲氨基团的氨基酸反应， 生成衍生物可被 反相高压液相色谱分离。 衍生物又具有荧光（ 也有紫 外吸收）使Ｆ Ｃ逐步成为 一 ， ＭＯ 个氨基酸分析中新 型柱前衍生剂。 该方法是Ｊｓｆｓ （） ｏｅｓ ｎ１提出的， ｅｏ １ 反应 式如图３ 所示。 Ｆ Ｃ与氨基酸反应迅速， ＭＯ 室温下约３ｓ ０即可 完成。 反应产物稳定， 在４ 避光条件下可储存１天 ３
（ 国家饲科 质量监督检验测 试中心 ， 北京 １０８ ） ００１
Hale Waihona Puke 测， 又可做一般的紫外吸收检测。 紫外检测线性范围
为 １－ ２０ｍ ｌ荧 光 为 ０８ １ｐ ｏ。 Ｐ 本身 不 ０ ０ｐ ｏ ．－ ５ｍ １ Ａ Ｏ
度以及 自动化程度有了很大的进步 ， 白 而且以此为 基础， 建立了食品、 饲料等有关 基酸分析的一系列 国际和国家标准。 然而， 随着氨基酸分析应用领域的 扩展， 氨基酸测定仪用途单 一结构复杂、 、 价格 贵 等缺点日显突出。 七十年代以来， 自 随着高效液相色 谱的发展， 特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生
柱前衍生化-超高效液相色谱法快速测定酱油中的18种氨基酸
酱油 中 １ ８种 氨 基 酸 的加 标 回收 率 为 ９ ．％ ～】３ ７ ０２ ０ ． ％。该 方 法 前 处 理 过 程 简 单 ， 离时 间 短 ， 检 测 酱 油 中 氨 基 酸 分 是
的 有 效 手 段 ， 用 于 酱油 的质 量 评 定 。 可 关 键 词 ： 前 衍 生 ； 高 效 液 相 色 谱 ；一 基 喹 啉 基一 羟 基 琥 珀 酰 亚 氨 基 甲酸 酯 ； 基 酸 ； 油 柱 超 ６氨 Ⅳ一 氨 酱 中图分类号 ：６８ ０ ５ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ —７ ３ ２ ｌ ） ２ ｌ ５ —４ １ ０ ８ ｌ （ ０ ０ １ 一 ｌ ４０ ０
摘 要 ： 立 了一 种 ６ 氨基 喹啉 基 一 羟 基 琥 珀 酰 亚 氨 基 甲酸 酯 （ Ｑ 柱 前 衍 生 ， 高 效 液 相 色 谱 （ Ｌ 对 酱 油 中 建 一 Ⅳ一 Ａ Ｃ） 超 ＵＰ Ｃ） １ 氨 基 酸 进 行 快 速 分 离 检 测 的方 法 。采 用 Ｂ Ｈ Ｃ ８色 谱 柱 分 离 ， ２ ０ ｎ ｔ 长 下 检 测 ， 乙 酸 铵 一 酸一 腈 － ８种 Ｅ １ 在 ６ ｌ 波 Ｔ 以 乙 乙 水 和 乙腈 一 乙酸 为流 动相 ． 流 动 相 梯 度 和 流 速 梯 度 相 结 合 ， ｌ ｎ内实 现 了 ｌ 将 在 ２ ｍｉ ８种 氨 基 酸 衍 生 物 的 分 离 。方 法 的线 性 回归 系数 （ 均 大 于 ０ ９ ９， 出 限 为 ０ ０ ２～ ． ２ ｍｇ Ｌ， ｒ） ．９ 检 ．３ ０ １ ／ 日间 相 对 标 准 偏 差 （ Ｓ 为 ０ ７ ％ ～ ． ５ 在 Ｒ Ｄ） ．２ ４ ０ ％，
２ ０年 １ ０１ ２月
Ｄｅｃ ｍ ｂｅ ０１ ｅ ｒ２ ０
色
谱
柱前衍生_高效液相色谱快速测定皮革和头发水解液中的氨基酸
Abstract Ob jec tive : T o deve lo p a fast H PLC m ethod for deter m ining 17 comm on am ino acids in hydro ly sate o f leather and ha ir . M ethods : Am in o acids w ere separated on D ionex A ccla i m C18 ( 4 . 6 mm
-1
150 mm, 5 m ) co lu mn
w ith in 32 m in using 140 mm o l L sod ium acetate buffer so lution at pH 4 . 45 and 4 . 95 for grad ien t elution w ith acetonitrile- w ater( 60 40 , v /v ) and UV for detection after derivatization w ith A ccQ T ag derivatization reagen. t Re sults : The RSDs( n = 5) of retention t i m e and peak area of all am in o ac id sw ere less than 1 . 1 % and 5 . 0% , respec t iv e ly. T he li m it of detect io n( S /N = 3) w as in th e range o f 2 . 92- 4 . 51 pm o,l the linear range w as in the range o f - 1 - 1 2 2 . 5- 500 m o l L ( 1 . 25- 250 m o l L for cystine) w ith R 0 . 998 . T he spiked recovery of leather and ha ir w ere in the range of 80 . 1 % - 102 . 3 % and 85 . 3% - 103 . 2 % , respect iv ely. Conclusion: T he m ain advantages of the m ethod are si m p lified for the preparatio n o f m ob ile phase , cost sav in g , h ig h speed and less m atrix in terfer ence . It can be used for am ino acids deter m in ation in hydro ly sate of leather and ha ir effective ly . K ey w ord s : a m ino ac id s ; H PLC; pre- co lum n derivatizatio n ; leather ; hair 随着现代皮革工业的发展, 皮革化工材料及制 革理论都不断向现代化迈进 , 由于生皮的主要组成 是蛋白质, 整个制革过程离不开对蛋白质的研究, 氨 基酸是构成蛋白质的基本单元 , 因此分析氨基酸可 对蛋白质与皮化材料的相互作用作深入研究 , 从而 可推动现代皮革工业的快速发展。而毛发是提取各 种天然氨基酸的原料, 因此对皮革与毛发中氨基酸
异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相法同时测定18种氨基酸
文对其实验过程进行了改进， 不用常规的两次蒸发， 仅以正己烷除去干扰因素， 过滤后直接进样分析， 从 而简化了实验步骤， 既节约了时间， 又降低了费用。 将该方法应用于测定含无机离子及小分子肽 （相对 分子质量小于 ） 、 氨基酸、 核苷酸、 低聚糖、 脂类 % " " " 等小分子有机物的小牛血去蛋白注射液中的游离氨 基酸， 结果令人满意。
# 结果
# " ! 对照品混合溶液和实际样品的分离结果 对照品混合溶液和小牛血去蛋白注射液中游离 氨基酸的色谱分离结果见图%和图0 。
图 ! 异硫氰酸苯酯衍生化法测定! %种氨基酸对照品混合溶液的色谱图 & ’ " ! ) * + , . / , + . -, 0 ! %. ’ 1 ,. 2 ’ 3 4 / . 1 3 . + 3 4 3 5 + ’ 6 . / ’ 7 5 38 ’ / *9 * 5 1 ; ’ 4 , / * ’ , 2 . 1 . / 5 ( ( : : ： （ ） ； ： ： ： * D C R B L . 9 D B @ < 7 C * 1! B， 0 & &B BE F ? GB B7 H I H : D C R B L S 8 B 8 9 @ S R 9 8 J 5K； I 8 S 8 : S 7 D LT @ ( 8 C 8 L S = 0 1 FL B； B D U 7 C = @ < 8 8 C R 8 L S’， ) Q ) % 5 ／ ； ， ； ： ， ； ， ； J P@ : 8 S D L 7 S 9 7 C 8 7 L& ? %B D C-< D I 7 R B@ : 8 S @ S 88 C R 8 L S2 5 & P@ : 8 S D L 7 S 9 7 C 8 7 LT @ S 8 9C 7 L 8 @ 9Q 9 @ I 7 8 L S 8 C R S 7 D L& ? &B 7 L& P2 % JB 7 LN P2 0 J ， ； ， ； ， ； ， ； ， ； ， ； ： ／ B 7 L0 J P2 0 MB 7 LJ 1 P2 J 1B 7 LF & P2 F &B 7 L% & & P2 F 1B 7 L% & & P2 F NB 7 L& P2 V C D T9 @ S 8% ? &B -B 7 L H （’ ） ； （W ） ； （ ） ； （W ） ； （Y ） ； （’ ） ； （+ ） ； % H @ < @ 9 S 7 : @ : 7 I < 0 H C R S @ B 7 : @ : 7 I C R J H < 8 9 7 L 8 ! 8 9 F H C : 7 L 8 C 1 H = 7 < S 7 I 7 L 8 7 < G H @ 9 7 L 7 L 8 9 N H S = 9 8 D L 7 L 8 = 9 ) ) Q Q X X Q Q （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； （ ） ； 5 H @ C @ L 7 L 8’ C @ M H 9 D C 7 L 8" 9 D % & H S 9 D < 7 L 8+ 9 % % H ( @ C 7 L 8Z @ C % 0 HB 8 S = 7 D L 7 L 8[ 8 S % J H : < S 8 7 L 8* < % F H 7 < D C 8 R : 7 L 86 C 8 % 1 H ) X X X X （） ； ； （" ） ； （+ ） ； （） 8 R % G H L D 9 C 8 R : 7 L 8 % N H = 8 L C @ C @ L 7 L 8 = 8 % 5 H S 9 S D = @ L 9 % M H C < 7 L 8 < H C 8 R : 7 L 8 ) X X ) ) ) X X
柱前衍生高效液相色谱法测定蚕蛹提取物中氨基酸含量
摘 要 目的 用 柱前 衍 生 法 测 定 蚕 蛹 提取 物 中氨 基 酸 含 量 ，方 法 以磺 酰 氯 二 甲胺 偶 氮 苯 （ Ａ Ｓ—Ｃ ） 衍 生 剂 ， 用 ＤＢ Ｌ作 采
柱 前 衍 生 高效 液 相 色谱 法 （ Ｐ— Ｐ Ｃ ， ＭＣ—Ｐｃ Ｄ Ｒ Ｈ Ｌ ）Ｙ ａｋＯ Ｓ—Ａ柱 （５ ｍｍ× ． ｍ ５ ２０ ４ ６ ｍ， ｍ） 流 动 相 Ａ为 ２ ｍｏ ＬＫ Ｐ 流 动 相 ， ５ ｌ Ｈ２Ｏ ， ／ Ｂ为 乙腈 ： 醇 ＝ ０ ３ ； 速 １５ｍ／ ｉ 梯 度 洗 脱 ， 测 波 长 ４ ６ ｍ， 温 ３ ℃ ， 果 各种 氨基 酸 均 具 有 良好 的线 性 关 系 （ 关 甲 ７ ：０ 流 ． ｌｍ ｎ 检 ３ｎ 柱 ５ 结 相 系数 ｒ ０ ９８ ０ ９９ ） 精 密 度 （ Ｓ ＝ ．９ ９～ ．９ ９ 、 Ｒ Ｄ＜１５ ％ ）稳 定性 （ Ｓ ３ ５ ％ ）平 均 回收 率 （ ８ ８ ％ ～１７ ８ ％ ） 测 定 蚕 蛹 提 取 物 ．０ 、 Ｒ Ｄ＜ ．０ 、 ９ ．３ ０ ．３ ， 中 氨基 酸 含 量 ， 含 有 人 体 必 需 氨基 酸 占总 氨 基 酸 含量 的 ４ ％ 以上 ， 论 该 方 法 简 便 实 用 ， 析 结 果 准 确 可 靠 ， 用 于 动 植 物 其 ０ 结 分 适 中 富 有氨 基 酸 含 量 的测定 。
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量
邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法检测珍珠粉中的氨基酸含量【摘要】目的测定珍珠粉中的氨基酸含量。
方法邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法，采用荧光检测，梯度洗脱。
结果该法在28 min之内分离出15种氨基酸。
结论该法样品用量少、灵敏度高、线性范围宽、重现性好，适于分离大量样品。
【关键词】高效液相色谱；柱前衍生法；氨基酸；珍珠粉Determination of the Contents of Amino Acids in Pearl Powder by RP-HPLC after Pre��column Derivation with O��Phthaldialdehyde (OPA)Abstract：ObjectiveIn this paper， we determined amino acids in pearl powder. Methods A manual pre-column derivation procedure has been developed by reversed-phase HPLC with O-phthalaldehyde and fluorescence detector. Results More than 15 amino acids were separated within 28 min. Conclusion The method is sensitive， precise and shows good repeatability.Key words：High��performance liquid chromatography；Pre��column derivation； Amino acids； Pearl powder随着生命科学和生物工程的发展，氨基酸作为组成生物大分子的基本单元，其分析方法受到重视。
20世纪70年代以后，反相高效液相色谱技术在氨基酸分析中得到广泛应用，使分离时间缩短。
柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量
㊀基金项目:山东省重点研发计划(Ｎｏ.２０１８ＧＳＦ１１８１３２)㊀作者简介:邓红英ꎬ女ꎬ研究方向:药学ꎬＥ－ｍａｉｌ:８４２６７１９７３＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:李永贵ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:新药研发ꎬＴｅｌ:１３５０５４０２３９０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｙｇ－１２３０＠１６３.ｃｏｍ柱前衍生高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中氨基酸的含量邓红英１ꎬ张永文２ꎬ李永贵３ꎬ４(１.山东大学齐鲁医院药品调剂科ꎬ山东济南２５００１２ꎻ２.济南市中心医院药剂科ꎬ山东济南２５００１４ꎻ３.山东省药学科学院ꎬ山东省化学药物重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１ꎻ４.山东省药学科学院ꎬ山东省医用高分子材料重点实验室ꎬ山东济南２５０１０１)摘要:目的㊀建立以２ꎬ４－二硝基氟苯为衍生化试剂ꎬ高效液相色谱法(ＨＰＬＣ)测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中各氨基酸含量的方法ꎮ方法㊀采用ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８色谱柱ꎬ乙腈－水(６０ʒ４０)为流动相Ａꎬ乙腈－磷酸盐缓冲液(９ʒ９１)流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ检测波长３６０ｎｍꎬ柱温２７ħꎮ结果㊀复方氨基酸注射液中各氨基酸分离度良好ꎬ线性相关系数均大于０.９９８９ꎬ平均回收率均在９８％~１０２％之间ꎬＲＳＤ％均小于２％ꎮ结论㊀本方法可以用于复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸检测ꎮ关键词:柱前衍生ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯ꎻ复方氨基酸注射液ꎻ１８ＡＡꎻ含量测定中图分类号:Ｒ９２７.２㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２０)０１－００２７－００４ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２０.０１.００６ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎｂｙＨＰＬＣａｆｔｅｒｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＤＥＮＧＨｏｎｇｙｉｎｇ１ꎬＺＨＡＮＧＹｏｎｇｗｅｎ２ꎬＬＩＹｏｎｇｇｕｉ３ꎬ４(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｉｓｐｅｎｓｉｎｇꎬＱｉｌｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＪｉｎａｎ２５００１２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＪｉｎａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＪｉｎａｎ２５００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬＪｉｎａｎ２５０１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ)ｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ)ｗｉｔｈ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＡｎＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎｗａｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎｗｉｔｈａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｗａｔｅｒ(６０ʒ４０)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ(９ʒ９１)ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ.Ｔｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ３６０ｎｍａｎｄｔｈｅｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ２７ħ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｇｏｏｄ.Ａｌｌｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ０.９９８９.Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅｂｅｔｗｅｅｎ９８％ａｎｄ１０２％ｗｉｔｈＲＳＤｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ２％.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｃｏｍｐｏｕｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎ(１８ＡＡ).Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎꎻ２ꎬ４－ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅꎻＣｏｍｐｏｕｎｄＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎꎻ１８ＡＡꎻＤｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎ㊀㊀复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)是一种含有合成人体蛋白质所需要的１８种氨基酸与其他辅料配制而成的灭菌水溶液ꎬ临床上主要用于蛋白质摄入不足以及吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要患者的治疗ꎬ也常用于改善手术后患者的营养状况[１]ꎮ由于氨基酸具有高极性㊁低挥发性㊁大部分无强发色基团的特性ꎬ因此其分离和检测都较为困难ꎬ目前常用的检测方法有氨基酸分析仪检测法㊁离子色谱法㊁柱前衍生高效液相色谱(ＨＰＬＣ)法等ꎮ方法存在仪器昂贵㊁运行费用高㊁衍生物不稳定且有一定毒性㊁各组分分离效果差㊁样品检测时间长等诸多问题[２－７]ꎮ本研究建立了２ꎬ４－二硝基氟苯作为衍生化试剂[８－９]ꎬ高效液相色谱法检测复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中氨基酸的方法ꎬ该方法分离效果好ꎬ且重现性稳定ꎮ１㊀仪器与试药１.１㊀仪器㊀高效液相色谱仪(ＬＣ－２０ＡＴ型泵㊁ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ型检测器ꎬＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎ液相色谱数据工作站ꎬ日本岛津公司)ꎻＢＴ１２５Ｄ分析天平(Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ)ꎻＰＨＳＪ－３Ｆ精密酸度计(上海雷磁仪器厂)ꎻ超纯水机(艾柯)ꎮ１.２㊀试药㊀门冬氨酸(批号:１４０６９１－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ谷氨酸(批号:１４０６９０－２０１２０３ꎬ纯度:１００％)ꎻ丝氨酸(批号:１４０６８８－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ甘氨酸(批号:１４０６８９－２０１６０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ苏氨酸(批号:１４０６８２－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ盐酸精氨酸(批号:１４０７８１－２００８０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ脯氨酸(批号:１４０６７７－２０１５０７ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ丙氨酸(批号:１４０６８０－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ缬氨酸(批号:１４０６８１－２０１２０２ꎬ纯度:９９.６％)ꎻ甲硫氨酸(批号:１４０６８４－２０１１０２ꎬ纯度:１００％)ꎻ胱氨酸(批号:１４０６３２－２００５０２ꎬ纯度:９９.３％)ꎻ异亮氨酸(批号:１４０６８３－２０１３０２ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ亮氨酸(批号:１４０６８７－２０１５０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ色氨酸(批号:１４０６８６－２０１３０３ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ苯丙氨酸(批号:１４０６７６－２００４０５ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸组氨酸(批号:１４０６９３－２００４０１ꎬ纯度:１００％)ꎻ盐酸赖氨酸(批号:１４０６７３－２０１５０９ꎬ纯度:９９.９％)ꎻ酪氨酸(批号:１４０６０９－２０１５１３ꎬ纯度:９９.８％)对照品均购自中国食品药品检定研究院ꎮ复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)(自制中试品ꎬ批号:２０１６０５０１㊁２０１６０５０２㊁２０１６０５０３)ꎻ２ꎬ４－二硝基氟苯(批号:２０１５１２２７１ꎬ纯度:９９.０％ꎬ成都艾科达化学试剂有限公司)ꎻ乙腈为色谱纯ꎻ碳酸氢钠㊁磷酸二氢钾㊁氢氧化钠㊁磷酸为分析纯ꎮ２㊀方法与结果[１０]２.１㊀溶液制备㊀配样溶剂:ｐＨ７.０磷酸盐缓冲液ꎮ混合对照品储备溶液:精密称取氨基酸对照品各适量ꎬ加水溶解ꎬ制成每１ｍＬ中含有门冬氨酸６２.４５μｇ㊁谷氨酸１８.８３μｇ㊁丝氨酸２５.１１μｇ㊁甘氨酸１９０.０２μｇ㊁苏氨酸６２.５０μｇ㊁盐酸精氨酸１２５.０２μｇ㊁脯氨酸２５.０８μｇ㊁丙氨酸５０.０６μｇ㊁缬氨酸８９.９５μｇ㊁甲硫氨酸５６.２５μｇ㊁胱氨酸２.６５μｇ㊁异亮氨酸８８.０５μｇ㊁亮氨酸１２２.１５μｇ㊁色氨酸２２.５０μｇ㊁苯丙氨酸１３３.２０μｇ㊁盐酸组氨酸６２.５２μｇ㊁盐酸赖氨酸１０７.５８μｇ㊁铬氨酸６.３０μｇ的混合溶液ꎮ混合对照溶液:精密量取混合对照品储备溶液２ｍＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ供试品溶液:精密量取复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入５％碳酸氢钠溶液１ｍＬ与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ摇匀ꎬ置６０ħ水浴中ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎮ空白溶液:按处方称取除氨基酸外的各组分ꎬ加水配成空白对照溶液ꎮ精密量取空白对照溶液５０μＬ至１０ｍＬ量瓶中ꎬ照供试品溶液配制方法配制成空白溶液ꎮ２.２㊀色谱条件㊀色谱柱:ＡｇｉｌｅｎｔＨＣ－Ｃ１８(４.６ｍｍˑ２５０ｍｍꎬ５μｍ)ꎬ流动相Ａ为乙腈－水(６０ʒ４０)ꎬ流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２)(９ʒ９１)ꎻ流速１.０ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ柱温２７ħꎬ检测波长:３６０ｎｍꎻ进样体积１０μＬꎮ梯度程序见表１ꎮ表１ 梯度洗脱程序表时间/ｍｉｎ流动相Ａ(％)流动相Ｂ(％)００１００２１５８５１２２４７６１４３１６９３２４１５９４０８０２０２.３㊀专属性试验㊀分别取 ２.１ 项下混合对照品溶液㊁供试品溶液及空白溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎮ记录色谱图及峰面积ꎮ试验结果表明ꎬ在本检测条件下ꎬ空白溶液对氨基酸检测无干扰ꎬ且１８种氨基酸分离良好(见图１)ꎮ２.４㊀定量限与检测限㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ加配样溶剂稀释ꎬ制成不同浓度梯度的溶液ꎬ按上述色谱条件进行测定ꎬ分别取各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎮ计算各氨基酸的定量限与检测限ꎮ２.５㊀线性试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照品储备溶液１㊁１.５㊁２㊁２.５㊁３ｍＬꎬ分别置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加入对应比例的５％碳酸氢钠溶液与１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液ꎬ摇匀ꎬ分别置６０ħ水浴ꎬ暗处加热ꎬ间隔２０ｍｉｎ振摇１次ꎬ６０ｍｉｎ后取出ꎬ放冷ꎬ加磷酸盐缓冲液(ｐＨ７.０)至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为线性试验溶液ꎬ分别取上述各溶液１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图及峰面积ꎬ以浓度Ｃ为横坐标ꎬ峰面积Ａ为纵坐标做线性回归ꎬ求得线性方程及相关系数ꎬ结果见表２ꎮ２.６㊀精密度试验㊀精密量取 ２.１ 项下混合对照溶液１０μＬꎬ注入液相色谱仪ꎬ连续进样６次ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ表明仪器精密度良好ꎮ２.７㊀溶液稳定性试验㊀取 ２.１ 项下混合对照溶液ꎬ分别于０㊁２㊁４㊁６㊁８㊁１２㊁２４ｈ精密量取１０μＬ注入液相色谱仪ꎬ记录色谱图ꎬ计算ＲＳＤꎬ结果各氨基酸峰面积ＲＳＤ均小于２％ꎬ说明混合对照品溶液２４ｈ内稳定ꎮ２.８㊀回收率试验㊀精密量取空白基质５０μＬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别加入１８种氨基酸对照品适量(约相当于处方量的８０％㊁１００％㊁１２０％)ꎬ照 ２.１ 项下供试品配制方法配制成回收率试验溶液ꎬ平行配制３份ꎮ依法测定ꎬ计算平均回收率及ＲＳＤꎬ结果见表３ꎮ㊀Ａ.空白溶液ꎻＢ.混合对照品溶液ꎻＣ.供试品溶液㊀１.门冬氨酸ꎻ２.谷氨酸ꎻ３.丝氨酸ꎻ４.甘氨酸ꎻ５.苏氨酸ꎻ６.盐酸精氨酸ꎻ７.脯氨酸ꎻ８.丙氨酸ꎻ９.缬氨酸ꎻ１０.甲硫氨酸ꎻ１１.胱氨酸ꎻ１２.异亮氨酸ꎻ１３.亮氨酸ꎻ１４.色氨酸ꎻ１５.苯丙氨酸ꎻ１６.盐酸组氨酸ꎻ１７.盐酸赖氨酸ꎻ１８.酪氨酸图１㊀ＨＰＬＣ图谱表２㊀各氨基酸组分线性方程㊁相关系数㊁线性范围㊁定量限与检测限名称线性方程相关系数线性范围/μｇ ｍＬ－１定量限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ３)检测限/ｎｇ(Ｓ/Ｎʈ１０)门冬氨酸Ａ＝６９７７０Ｃ＋４７４０６０.９９９５６.２４５０~１８.７３５００.１２０.０４谷氨酸Ａ＝５７０５５Ｃ＋１１９２００.９９９２１.８８３０~５.６４９００.０９０.０４丝氨酸Ａ＝８７２１４Ｃ＋１３２０４０.９９９２２.５１１０~７.５３３００.０５０.０２甘氨酸Ａ＝１２４６０２Ｃ＋１７９５６８０.９９９６１９.００２０~５７.００６００.１３０.０３苏氨酸Ａ＝８２４５８Ｃ＋５４４３００.９９９６６.２５００~１８.７５０００.１３０.０４盐酸精氨酸Ａ＝４４７０８Ｃ＋５５２７００.９９９２１２.５０２０~３７.５０６００.２５０.０９脯氨酸Ａ＝６０９７５Ｃ＋１７５３５０.９９９４２.５０８０~７.５２４００.１３０.０５丙氨酸Ａ＝１０４７８０Ｃ＋５６３７７０.９９９４５.００６０~１５.０１８００.１００.０４缬氨酸Ａ＝５８３１４Ｃ＋５６３７７０.９９９４８.９９５０~２６.９８５００.１８０.０６甲硫氨酸Ａ＝６３８０３Ｃ＋３４２８７０.９９９２５.６２５０~１６.８７５００.２８０.１１胱氨酸Ａ＝１ˑ１０６Ｃ＋３４２８７０.９９９２０.２６５０~０.７９５００.１５０.０６异亮氨酸Ａ＝７２２６１Ｃ＋６６２９６０.９９９３８.８０５０~２６.４１５００.１８０.０６亮氨酸Ａ＝７１２５６Ｃ＋８９５９５０.９９９３１２.２１５０~３６.６４５００.２５０.０９色氨酸Ａ＝３４７７８Ｃ＋９０５１.７０.９９９１２.２５００~６.７５０００.３５０.１２苯丙氨酸Ａ＝５７５９９Ｃ＋７１０４６０.９９９５１３.３２００~３９.９６０００.２３０.０８盐酸组氨酸Ａ＝２４５４３４Ｃ＋７１０４６０.９９９５６.２５２０~１８.７５６００.６１０.１２盐酸赖氨酸Ａ＝２３３１８Ｃ＋４９２２３０.９９９７１０.７５８０~３２.２７４００.０８０.０２酪氨酸Ａ＝５４８７８Ｃ＋２３０４０.９９９１０.６３００~１.８９０００.９４０.３１表３㊀回收率试验结果名称平均回收率(％)ＲＳＤ(％)门冬氨酸９９.８００.７８谷氨酸１００.１９０.７９丝氨酸１０１.０９１.９３甘氨酸９９.５６１.３８苏氨酸１０１.２４１.４２盐酸精氨酸１００.１２１.０３脯氨酸９８.７３０.５２丙氨酸９９.９５０.６８缬氨酸９８.８７０.９９甲硫氨酸１００.３４１.３９胱氨酸９９.１６１.８２异亮氨酸９９.５８０.９２亮氨酸１００.２２１.８０色氨酸１００.０８１.４５苯丙氨酸９９.９３１.１７盐酸组氨酸９９.８０１.７０盐酸赖氨酸１００.２３１.２７铬氨酸９９.７７１.４０２.９㊀样品检测㊀取本品３批ꎬ照 ２.１ 项下方法制备混合对照溶液及供试品溶液ꎬ照 ２.２ 项下色谱条件检测各氨基酸含量ꎬ结果见表４ꎮ表４㊀样品测定结果名称含量(％)２０１６０５０１２０１６０５０２２０１６０５０３门冬氨酸９９.６８１００.２７１００.９９谷氨酸９９.１９９９.１５１００.１７丝氨酸１００.４３９９.５０１０１.５５甘氨酸９９.９５１００.０７１０１.３１苏氨酸１００.２９１００.４３１０１.８７盐酸精氨酸１００.５１１００.６０１０１.７８脯氨酸９９.６７１００.４８１０１.０１丙氨酸９９.６８１００.７２１０１.０２缬氨酸９９.７０９９.７０１０１.０３甲硫氨酸１００.２４１００.０８１０１.３０异亮氨酸１００.０６９９.０３９８.２９亮氨酸１０１.２３１０１.２９１０２.５４色氨酸９９.９７１００.８２１０１.２６苯丙氨酸１００.７９１０１.０５１０２.７９盐酸组氨酸９９.９４９９.８６１０１.４７盐酸赖氨酸１０１.４２１０１.１５１０１.１８酪氨酸１０１.１７１００.９５１０２.０５３ 讨论３.１㊀衍生化条件选择㊀本研究分别对衍生化试剂用量㊁衍生化温度及衍生化时间进行研究ꎬ结果使用１％的２ꎬ４－二硝基氟苯乙腈溶液１ｍＬꎬ在６０ħ条件下衍生化１ｈꎬ样品中各氨基酸均能衍生化完全ꎬ样品检测重复性好ꎮ３.２㊀流动相研究㊀本研究流动相Ｂ为乙腈－磷酸盐缓冲液(０.０１４ｍｏｌ Ｌ－１的磷酸盐缓冲液ｐＨ８.２) (９ʒ９１)ꎬ９％的乙腈能防止流动相长菌㊁沉淀ꎬ延长流动相使用时间ꎻ磷酸盐浓度对氨基酸的分离效果有改善作用ꎻｐＨ值８.２要求选用耐碱色谱柱进行试验ꎮ３.３㊀柱温研究㊀本研究最佳柱温为２７ħꎬ研究发现柱温波动对色氨酸与组氨酸分离影响较大ꎬ当柱温在(２７ʃ１)ħ时ꎬ各氨基酸能较好地分离ꎮ３.４㊀本检测方法胱氨酸可以与其他氨基酸完全分离ꎬ但是由于其含量低ꎬ检测浓度接近定量限浓度ꎬ因此含量测定时未做计算ꎮ参考文献:[１]㊀李莉ꎬ崔红艳ꎬ钟佳琪ꎬ等.ＨＰＬＣ法同时直接测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中的蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜[Ｊ].分析实验室ꎬ２０１８ꎬ３７(１１):１３０９－１３１４.[２]谢升谷ꎬ胡楚楚ꎬ黄巧巧ꎬ等.ＨＰＬＣ法测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)中焦谷氨酸的含量[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２０１５ꎬ３４(４):７０５－７０９.[３]国家药典委员会.中华人民共和国药典２０１５年版(二部)[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:８１１－８１２. [４]ＬＩＷꎬＨＯＵＭꎬＣＡＯＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ２０ｆｒｅｅａ￣ｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎａｓｐａｒａｇｕｓｔｉｎｂｙｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｍｅｔｈｏｄａｆｔｅｒＰｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ[Ｊ].ＦｏｏｄＡｎａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１２ꎬ５(１):６２－６８.[５]陈建秋ꎬ王玉红ꎬ李鹏ꎬ等.核壳液相色谱－蒸发光散射检测法直接检测２０种氨基酸[Ｊ].上海医药ꎬ２０１５ꎬ３６(１１):７５－７９.[６]陈丽梅ꎬ尚艳芬ꎬ赵孟彬ꎬ等.柱前衍生化－超高效液相色谱法快速测定酱油中的１８种氨基酸[Ｊ].色谱ꎬ２０１０ꎬ２８(１２):１１５４－１１５７.[７]万丹晶ꎬ陈妙芬ꎬ翟咏虹.用ＨＰＬＣ法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中１８种氨基酸[Ｊ].药学服务与研究ꎬ２００６ꎬ６(３):２１２－２１４.[８]楼永明ꎬ林敏ꎬ陈秀琳.ＨＰＬＣ测定复方氨基酸注射液(１８ＡＡ)有关物质的初步研究[Ｊ].中国药品标准ꎬ２０１９ꎬ２０(１):３７－４１.[９]付宜和ꎬ杨国庆ꎬ龚道芬ꎬ等.２ꎬ４－二硝基氟苯柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液ＨＰＬＣ色谱条件的优化[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２００５ꎬ２５(７):７６２－７６４.[１０]李永贵ꎬ张锡霞ꎬ王晶ꎬ等.一次性使用无菌注射器中抗氧剂１０１０的迁移研究[Ｊ]生物医学工程研究ꎬ２０１６ꎬ３５(２):１３３－１３５.。
柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸
D0I：10.13822/ki.hxsj.2021007962化学试剂，2021,43(6),801〜805柱前衍生-高效液相色谱法测定新鲜烟叶中游离氨基酸许永「，黄丽佳一2，刘欣1,李晶「，宋春满"，杨光宇1,李雪梅1(1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650106；2.昆明医科大学药学院，云南昆明650504)摘要:建立了柱前衍生-高效液相色谱检测新鲜烟叶中18种游离氨基酸的分析方法。
0.2g样品用5mL超纯水超声提取30min,过滤后取0.5mL滤液以异硫氰酸苯酯(PITC)衍生，以Waters SunFire C18色谱柱为分析柱，80%乙睛和0.1mol/L乙酸钠水溶液为流动相，梯度洗脱，在254nm处检测，外标法定量。
结果表明，18种氨基酸的线性范围为2~ 50wg/mL，定量限为0.03〜0.10mg/g,3个水平加标平均回收率在84.6%-105%之间，相对标准偏差为1.7%~5.5%-该方法简便快速，适用于新鲜烟叶中18种游离氨基酸的含量分析-关键词:柱前衍生;高效液相色谱;烟叶;游离氨基酸中图分类号：0652文献标识码：A文章编号：0258-3283(2021)06-0801-05Determination of Free Amino Acids in Fresh Tobacco Leaves by High Performance Liquid Chromatography with Precolumn Derivatization XU Yong1,HUANG Li-jia'，,LIU Xin,LI Jing',SONG Chun-man*1,YANG Guang-yu',LI Xue-mei (1.Technology Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming650106,China；2.School of Pharmacy,Kunming Medical University,Kunming650504,China),Huaxue Shiji,2021,43(6),801〜805Abstract:A method was developed for the determination of18free amino acids in fresh tobacco leaves by pre-column derivatiza-tion-high performance liquid chromatography.0.2g Sample was extracted by ultrasonication with5mL ultrapure water for30min, filtrated and then0.5mL of the filtrate was derived with phenyl isothiocyanate(PITC)and analyzed on a Waters SunFire C18 column with80%acetonitrile and0.1moL/L aqueous sodium acetate solution as mobile phase.Derivatives were detected at the wavelength of254nm and quantified with external standard method.The results showed that the linear ranges of18free amino acids were2~50wg7mL,and the limits of quantitation were0.03〜0.10mg/g,and the average recoveries of18free amino acids were in the range of84.6%-105%with relative standard deviations of1.7%〜5.5%.The method is simple and suitable for the analysis of18free amino acids in fresh tobacco leaves.Key words:pre-column derivatization；high performance liquid chromatography；tobacco leaves；free amino acids氨基酸是烟草中一类重要化合物，在烟草生长、调制、醇化、加工直至成品卷烟抽吸过程中,氨基酸与烟草中的还原糖发生非酶棕化反应,生成多种香味前体物质,某些氨基酸如苯丙氨酸还可以自身分解成香味化合物,对形成芳香的烟草香气和吸味有重要贡献［1］-因此，分析烟草中氨基酸含量，对烟草品质评价及卷烟配方设计等均有重要意义-烟草氨基酸的分析方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有离子色谱-脉冲安培检测法［2,3］和液相色谱-串联质谱法［4-6］。
高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量
河 北 医 科 大 学 学 报JO U RN A L OF HEBEI M ED ICA L U NI VER SI T YV o 1.17 No .3 1996高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量许彦芳 许新民 王永利药理教研室(050017) 摘 要 本文利用高效液相色谱(HP L C )柱前邻苯二甲酝酿(OP A )自动衍生、自动进样程序测定脑组织中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、牛磺酸和r -氨基丁酸含量。
该法的最低检出限为10nmol /ml ,5种氨基酸峰面积测定值的变异系数平均为2.0±1.3%,线性相关系数平均为0.97±0.03。
关键词 HPL C;氨基酸;OP A ;自动衍生;自动进样HPLC -PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OFAMINO ACIDS BY AUTOMATIC PRECOLUMN DERIVATIZATIONXu Yan fang Xu Xinmin Wang YongliDep artment of Ph armacologyABSTRACT Glutamate,asparate,glycine,taurine and GABA in brain w ere seperated and determined by HPLC system of the autom atic processes of precolum n o -phthaldialdehydeder iv atization and injection .Average co efficient o f variatio n for peak areas of 5amino acids w as 2.0±1.3%w ith the detectio n lim it o f 50ng.Av erag e line co orelatio n coefficient w as 0.97±0.03.KEY WORDS HPLC ;o -phthaldialdehyde ;amino acids ;automatic derivatizatio n ;au-tom atic injection 生物样品中的微量氨基酸测定在医学领域中占重要地位。
柱前衍生化高效液相色谱法测定百合中的氨基酸含量
Ａｂｓｒ ｅ： ＲＰＨＰ Ｃ ｔｏ ｏ ｈ ｅｅｍｉａｉｎｏ ｍｉｏａ ｉ ｎＬⅢｕ ｗａ ｓａ ｌ ｈ ｄ ＯＤＳ ｐ ｒｉ Ｃ１ ｏｕ （ ｔａ ｔ Ａ Ｌ ｍｅｈ ｄｆｒｔｅｄ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆａ ｎ ｃｄ ｉ ｍ ｓｅ ｔｂｉ ｅ Ａ ｓ ２ Ｈｙ ｅｓ１ ８ｃ ｌｍｎ４６ｍｍｘ ５ ２ ０ｍｍ．５ｐ ｗａ ｍ） ｓ
ｍ
２ ～ ６ ６ ｍｉ．ｆ ｍ ５％－ ０％ ： ６ ６ ３ ｎ ｆｏ ８ ３ ６ ２ ． ｎ ｆ ｏ ６ ８ ２ ～ ２ ｍｉ ． ｒ ｍ ０％～ ５％ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗｅ ｈ ｔｌ ｉｄ ｆａ ｎ ｃ ｄ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｉ ｌ ｍ ｓ ｅ ｉｌ ｒ Ａｍｉ ｏ ９ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｋ ｎ ｓｏ ｍｉ ｏ ａ ｉ ｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉｅ ｎ Ｌｉｕ ｅ ｐ ｃａｌ Ｐ ｏ ｓ ３ ｉ ｙ ｎ
ｕ ｅ ｔ ｏ ｕ ｉ ｎ Ａ ｆ ａ ｃｔｉｔ ｙ ａ ｉ ｅ ＴＨＦ ｎ Ｏ Ａｃ ａ ｅｏ ｉ ｉｅｍ ｅｈ ｎ ｌａ ｂ ｌ ｈ ｓ Ｃｏｕ ｎ ｔｍ ｐ ｒ ｔ ｒ ５ ℃ ａ ｄ ｄ ｔ ｃ ｉｎ ａ ３ ｍ Ｔｈ ｓ ｄ ｗｉ ｓ ｌ ｔ ｏ Ａ — ｅ ｈ ｌｍ ｎ ． ｈ ｏ Ｎ ｒ ａ ｄ Ｂ ｆＮａ — ｃ ｔ ｎ ｔ ｌ ． ｔ ａ ｏ ｓ ｍｏ ｉ ｐ ａ ｅ ｒ ｅ ｌｍ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ３ ｎ ｅｅｔ ｔ ０ｎ ｏ ３ ｅ Ｖｏｕ ａ ｔ ｎ ｏ ｏ ｉ ｈ ｓ ｓ ｒ ｇ ａ ｌ ｍｎｆ ｃｉ ｆＢ ｍ ｂ ｌ ｐ ａ ｅｗａ ｏ ｒ ｍｍ ｅ ｎ ａｌ ｅ ｔ ｎ ｓｆｌ ｗｓ ０ ２ ｎ ｆｏ — ０ ％ ： ２ ２ ｉ ．ｒ ｍ Ｏ ％～ ０％ ： ３ ２ ｉ，ｒ ｍ ０％ － ５％ ： ｒ ｏ ｅ ｐ ｄｌ ｅ ｒ ｉ ｓ ｃ ｉ ｓａ ｏｌ ｉ ｙｎ ｏ ｏ ： － ２ ｍｉ ．ｒ ｍ ０％ ４ ２ ～ ３ｍ ｎ ｆｏ ４ ６ ２ － ３６ｍ ｎ ｆ ｏ ６ ６
AQC柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中游离氨基酸
AQC柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中游离氨基酸王亚超;曹玲;王玉【摘要】Purpose A pre-column derivatization method by HPLC was established for the determination of free amino acids in Weilening Tablets. Methods The sample was mixed with 2-amino butyric acid as the internal standard, then derivatized with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) and analyzed on a Kromasil C18 column(250 mm × 4.6 mm ,5 μm) ,with ammonium acetate solution( pH 5.10) and acetonitrile solution as mobile phase,using gradient elution with detection at 248 nm. Results The correlation coefficients between the ratios of peak area of amino acid to those of the internal standard and the amino acid concentrations were above 0.999. The average recoveries of amino acids added were 91.5％ -107.0％ and RSD was 0.63％ -3.79％. Conclusion The method could be used for determination of content of free amino acids in Weilening Tablets.%目的:建立柱前衍生高效液相色谱法测定胃乐宁片中各种游离氨基酸的方法.方法:以α-氨基丁酸为内标,以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生化试荆,采用Kromasil C(18)(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,醋酸铵缓冲液(pH5.10)和57%乙腈水溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为248nm,同时分离测定胃乐宁片中21种游离氨基酸.结果:21种氨基酸在0.01-0.5 mmoL/L浓度范围内有良好的线性关系.r均不小于0.999,平均加样回收率为91.5%-107.O%,RSD为0.63%-3.79%.结论:建立的方法可用于检测胃乐宁片中游离氨基酸含量,测定的结果为胃乐宁片质量研究和评价提供了依据.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)004【总页数】4页(P300-303)【关键词】胃乐宁片;6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯;柱前衍生;氨基酸;含量测定【作者】王亚超;曹玲;王玉【作者单位】中国药科大学,江苏南京,210009;江苏省食品药品检验所,江苏南京,210008;中国药科大学,江苏南京,210009;江苏省食品药品检验所,江苏南京,210008【正文语种】中文【中图分类】R927.1猴头菌[Hericium erinaceus(Rull ex F.)Pers.]又名猴头菇、剌菌或猬菌，是最早加工成中成药的药用菌之一，因用子实体作原料成本较高，生产中多用固体培养的菌丝体代替子实体作原料。