1.2基因工程的基本操作程序

50℃
Taq
72℃
Taq

PCR的基本原理
第2轮结束


PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点
聚合酶链式反应 ，是一项 ① 概念：PCR全称为_______________ DNA片段的核酸合成技术。 在生物体外 ____复制特定 ___________ DNA复制 ②原理：__________
半乳糖苷酶
酶
酶
思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使 用受体生物自身基因的启动子才能有导入受体细 胞无法转录。

思考2：终止子的作用是什么？
终止子是位于基因尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的转录。
思考3：标记基因有什么作用？
是为了鉴别受体细胞中是否含有目 的基因，从而将有目的基因的细胞筛选 出来。
延伸 70-75˚C
退火
55-60˚C
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80
60
40 20 40 50 100 60 70 80 90
(%)
温度(℃)
PCR技术扩增与DNA复制的比较
相 原理 同 原料 点 条件 PCR技术 DNA复制 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下 解旋酶催化 变性解旋
如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA；受体菌，菌中含基因。
（二）利用PCR技术扩增目的基因
PCR反应
1 2 3
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94
人工合成 (基因比较小)
DNA合成仪
归纳：获取目的基因的方法从基因中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成

二、构建表达载体 —— 核心
1.过程: 用一定的_________ 限制酶 切割 质粒，使其出现一个切 黏性末端 口，露出____________ 。 同一种限制酶 切断目 用_____________ 的基因，使其产生_____ 相同的黏性末端 ____________。 切口 处， 将切下的目的基因片段插入质粒的______ DNA连接酶 ，形成了一个重组 再加入适量___________ DNA分子（重组质粒）
优点 缺点
工作量大，盲目， 鸟枪法 分离出来的有时并 非一个基因 操作过程麻烦， 反转录法 专一性强 mRNA很不稳定，要 求的技术条件较高 根据已知氨基 仅限于合成核苷酸 酸合成DNA法 专一性最强 对较少的简单基因 操作简便 因的有关信息。
根据已知蛋白 蛋白质的氨基酸序列 质的氨基酸序列， 推测 推测出相应的信使 RNA序列，然后按 mRNA的核苷酸序列 照碱基互补配对原 推测 则，推测出它的结 构基因的核苷酸序 结构基因的核苷酸序列 化学合成 列，再通过化学方 目的基因 法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。
上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽 孢杆菌 提取 普通棉花(无抗虫特性) 与运载体DNA拼接 导入
抗虫基因
棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性)
基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的获取 （2） 基因表达载体的构建 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定

一、目的基因的获取
1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结 构基因，也可以是一些具有调控作用增目的基因； （3）通过DNA合成？ 将含有某种生物不同基因的许多 DNA片断，导入到受体菌的群体中， 各个受体菌分别含有这种生物的不同 基因，称为基因。非编码区 编码区上游 启动子
原 核 细 胞 的 基 因 结 构 编 码 区
编码区
非编码区 编码区下游 终止子
：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 ①不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。 ②有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。
非 编 码 区
过程:
质粒 DNA分子 同一种 限制酶处理 一个切口和两个黏 性末端(两个切口四 个和粘性末端) DNA连 接酶 重组DNA分子（重组质粒） 两个切口 获得目的基因
2.构建基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
资 料:
科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败， 才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载 体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗 虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 (抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉 花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动 子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末 端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了 抗虫能力。
引物1
引物2

PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物


PCR反应条件 PCR过程 72℃ PCR的特点
引物1
引物2 Taq酶

PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始


PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
PCR反应条件 95℃ Taq PCR过程 PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 形 成
温 度 72 （℃）
55
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
DNA 2
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
22
DNA双螺旋
1 2 3 4 5
时间（min）
95℃
模板DNA

PCR的基本原理
DNA引物


PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点50℃
某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
可以部分基因可以基因组的构建模式图通过对 受体菌 的培法 多用于原核生物
人 （2）反转录法 工 合 成 （3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 法 （真核生物）
（1）鸟枪法：(直接分离法)
供体细胞中的DNA 限制酶 许多DNA片段
解旋 不 方式 同 场所 体外复制 细胞核内 点 酶 热稳定的DNA聚合酶 片段
形成整个DNA分子
（三）化学方法人工合成目的基因
根据已知蛋白质 蛋白质的氨基酸序列 的氨基酸序列，推测 推测 出相应的mRNA序列， 然后按照碱基互补配 mRNA的核苷酸序列 对原则，推测出它的 推测 结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法， 结构基因的核苷酸序列 化学合成 以单核苷酸为原料合 成目的基因。 目的基因

变性、退火、延伸三步曲 过程：
变性：加热至90～ 95℃双链DNA解链成 为单链DNA
退火：冷却至55～ 60℃部分引物与模 板的单链DNA的特定 互补部位相配对和 结合
变性
延伸
延伸：加热至70～ 75℃以目的基因为 模板，合成互补的 退火 新DNA链
⑥过程： a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 氢键 断裂，形成___________ 单链DNA 在热作用下，_____ b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 双链 。 物与DNA模板结合，形成局部________ c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 DNA链 。 的________
基因表达的计算
转录 DNA mRNA 翻译
蛋白质
氨基酸数
碱基数
6

3
1
在真核生物中，对应的是中内含子 基因多少 物种间基因交流cDNA基因组小 无 无
大 有 有
与载体连接
目的基因
运载体 导入 外源DNA扩增 受体细胞
分离
产生使RNA为模板， 再反转录酶的催化下反转录成互补的单链 DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链 DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。
（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
已知基因的核苷酸序列 ； ③前提条件：_______________________ 模板DNA 、___________ DNA引物 、 原料：___________ 热稳定DNA聚合酶 、 ________________ 四种脱氧核苷酸 。 __________________ 指数 方式扩增，即____ ④方式：以_____ 2n （n为扩增循 环的次数） ⑤结果： 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增
思考：作为基因工程表达载体，
只需含有目的基因就可以完成任务 吗？为什么？（P15） 不可以。
因为目的基因在表达载体中得到表达 并发挥作用，还需要有其他控制元件，如 启动子、终止子和标记基因等。
必须构建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自 身基因的启动子才能比较导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一 些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率 的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任 何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的 什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做 成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白 基因等。
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次， 理论上至少需要几个引物？
（24-1）×2=30
2×（2n-1）(n为循环次数)
PCR总结：PCR体系基本组成成分

模板DNA 特异性引物
一对寡核苷酸序列：与目的基因 的起始段互补