桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰及其抗氧化活性
桦褐孔菌多糖的体外抗氧化作用研究
桦褐孔菌多糖的体外抗氧化作用研究回晶;宋雅娜;孙秀娟;邹志远;刘宏生【期刊名称】《食用菌学报》【年(卷),期】2006(13)2【摘要】A crude polysaccharide fraction (PIO) from fruit bodies of the medicinal mushroom, Inonotus obliquus, exhibited strong ·OH scavenging activity as measured by the salicylic acid method. PIO also inhibited endogenous and Fe2+-Cys-induced lipid peroxidation, and mitochondrial swelling induced by the Fe2+- vitamin C system. It is proposed that the underlying anti-oxidation mechanism involves the initial elimination of ·OH radicals, which in turn suppresses peroxidation and protects membrane systems.%从桦褐孔菌子实体得到的多糖粗提物(polysaccharides from Inonotus obliquus, PIO)具有清除·OH、抑制自发性和Fe2+-Cys诱导过氧化脂质生成和减轻肝线粒体肿胀的效果.通过实验推测其抗氧化的机制是通过清除·OH,抑制·OH导致的过氧化从而保护膜系统.【总页数】7页(P29-35)【作者】回晶;宋雅娜;孙秀娟;邹志远;刘宏生【作者单位】辽宁大学生命科学系,沈阳,110036;辽宁大学生命科学系,沈阳,110036;辽宁大学生命科学系,沈阳,110036;辽宁大学生命科学系,沈阳,110036;辽宁大学生命科学系,沈阳,110036【正文语种】中文【中图分类】S567.390.1【相关文献】1.桦褐孔菌多糖IOP3a的分离纯化及其体外抗肿瘤活性研究 [J], 陈义勇;顾小红;汤坚2.药用真菌桦褐孔菌多糖的降糖实验研究 [J], 周秀梅;赵静宇;王美;郭素萍;杨文彬3.辐照桦褐孔菌提取物抗氧化作用的研究 [J], 池春樱;郑玲辉;常艳秋;李胜立;崔承弼;4.桦褐孔菌纯化多糖体外降血糖活性研究 [J], 王梦雅; 赵喆禛; 薛娇; 胡锦荣; 张京生; 刘萍5.刺激因子对桦褐孔菌胞外多糖体外降血糖活性的影响 [J], 赵喆禛;王梦雅;薛娇;张嘉铭;刘萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物抗糖尿病活性研究进展
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物抗糖尿病活性研究进展桦褐孔菌是一种生长在北半球的广泛分布的真菌，具有很高的药用价值。
近年来，人们对桦褐孔菌固体发酵菌质水提物在糖尿病治疗中的活性研究逐渐增多，取得了一系列进展。
本文就桦褐孔菌固体发酵菌质水提物抗糖尿病活性的研究进展进行概述。
1. 桦褐孔菌固体发酵菌质水提物的分离与鉴定桦褐孔菌是一种高档食用真菌，在野外生长丰富。
通过分离和鉴定，研究者们成功地从野生桦褐孔菌中分离出一株高产菌株，并利用其进行固体发酵。
经高效液相色谱法测定，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物中含有多种活性成分，如多糖、蛋白质、黄酮类、甾醇类等。
研究发现，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物具有明显的降血糖、抗氧化、抗炎和调节免疫功能的药理活性。
在实验动物中，给予桦褐孔菌固体发酵菌质水提物能够显著降低血糖水平，改善胰岛功能，提高机体的抗氧化能力，并能够调节免疫系统，减轻炎症反应。
针对糖尿病患者，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物也进行了临床应用研究。
多项临床试验证实，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物可以有效降低糖尿病患者的血糖水平，改善胰岛功能，减轻症状，提高生活质量。
近年来，研究者们对桦褐孔菌固体发酵菌质水提物的作用机制进行了深入探讨。
研究发现，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物可以通过多种途径发挥其抗糖尿病活性，包括通过调节胰岛素分泌和抗氧化作用，改善葡萄糖代谢，减轻胰岛素抵抗，抑制炎症反应等途径。
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物在抗糖尿病活性研究方面取得了一系列进展，为糖尿病的治疗提供了新的思路和方法。
目前的研究尚处于实验室和临床试验阶段，仍需要进一步的深入研究和临床验证。
相信随着研究的不断深入，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物一定会为糖尿病患者带来更多的益处。
桦褐孔菌提取物体外抗氧化活性评价研究
桦褐孔菌提取物体外抗氧化活性评价研究马思慧;程萍;方研;王萍【摘要】用不同浓度的乙醇、丙酮和异丙醇提取桦褐孔菌中的活性成分,筛选出高效抗氧化活性成分.分别用苯酚-硫酸法、福林酚法、氯化铝显色法测定粗提物中多糖、多酚和黄酮的含量,并测定粗提物对DPPH·的清除能力和FRAP值.用SPSS软件分析活性成分含量和抗氧化性的相关性,确定高抗氧化活性成分为多糖,与DPPH·清除率和FRAP总还原力的相关系数分别为为0.851和0.706.【期刊名称】《中国林副特产》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】4页(P4-7)【关键词】桦褐孔菌;提取;抗氧化;多糖【作者】马思慧;程萍;方研;王萍【作者单位】东北林业大学林学院,哈尔滨150040;东北林业大学林学院,哈尔滨150040;东北林业大学林学院,哈尔滨150040;东北林业大学林学院,哈尔滨150040【正文语种】中文桦褐孔菌［Inonotus obliques（Fr.）Pilát］是来自西伯利亚原始森林中的药用真菌，具有预防心血管疾病、神经细胞衰老、癌症、糖尿病等疾病的功效［1-5］。
这些功能的发挥与其抗氧化活性密不可分。
因此相关领域的研究主要集中在其抗氧化活性，但对于其提取物中哪种物质的抗氧化性较好鲜有报道。
鉴于此，本实验通过对不同溶剂的提取物体外抗氧化活性的评价，分析各活性物质含量与抗氧化指标的相关性，确定高效抗氧化活性成分，为以后对桦褐孔菌的进一步利用提供参考。
1 材料与方法1.1 材料与试剂桦褐孔菌，黑龙江省哈尔滨市东北林副特产专营店；DPPH，Sigma Aldrich公司；总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法），碧云天生物技术研究所；2-硫代巴比妥酸，上海源叶生物科技有限公司；2-脱氧-D-核糖，上海拜力生物科技有限公司；槲皮素标准品，中国药品生物制品检定所。
1.2 仪器与设备722 型可见光分光光度计上海光谱仪器有限公司；JA2003型电子天平上海良平仪器仪表有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机上海安亭科学仪器厂；SHB-B循环水式真空泵郑州长城科工贸公司；DG3022型酶标仪华东电子管厂。
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物抗糖尿病活性研究进展
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物抗糖尿病活性研究进展
桦褐孔菌是一种木材腐朽真菌，也被称为猪肝菌或熏肉蘑菇。
研究表明，桦褐孔菌中
含有丰富的多糖类物质和生物活性化合物，具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗趋化、
抗炎、抗癌等。
此外，桦褐孔菌还被认为是一种潜在的抗糖尿病药物。
1.抗高血糖活性
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物对高葡萄糖诱导的胰岛素抵抗具有一定的保护作用。
在
一项研究中，将雄性小鼠随机分为对照组、模型组和不同剂量桦褐孔菌固体发酵菌质水提
物处理组。
结果发现，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物可以显著降低血糖、胰岛素水平和胰
岛素抵抗指数（HOMA-IR），提示其可能具有改善胰岛素抵抗的作用。
2.保护胰岛细胞活性
4.促进胰岛素分泌
桦褐孔菌固体发酵菌质水提物还可以促进胰岛素分泌。
在一项研究中，使用β细胞
中的INS-1株，分别添加不同几率的热水提取物，以测定其直接对胰岛素分泌产生的影响。
结果表明，在高糖条件下，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物能够剂量依赖性地提高胰岛素分泌。
结论
综上所述，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物具有很好的抗糖尿病活性，包括抗高血糖、
保护胰岛细胞、降低血脂和促进胰岛素分泌等作用。
尽管研究还处于早期阶段，但这些研
究结果表明，桦褐孔菌固体发酵菌质水提物可能成为一种潜在的治疗糖尿病的天然药物。
未来的研究应该更加侧重于了解其抗糖尿病机理和安全性。
桦褐孔菌多糖的提取工艺优化及抗氧化活性评价
本研究以多糖提取率为指标 ，先采用单 因素试验确 定超声波法提取桦褐孑 Ｌ 菌多糖的因素和水平 ，再采用正 交试验法确定超声波法 的最佳 提取工艺 ，同时还对 比了 不同产地的桦褐孔菌多糖提取率和抗氧化能力 ，证实超 声波法未破坏桦褐孑 Ｌ 菌多糖的生物活性 。为 日后桦褐孔
天平 Ｍ Ｅ Ｔ Ｆ Ｌ Ｅ Ｒ Ｔ Ｏ Ｌ Ｅ Ｄ Ｏ — Ｍ Ｅ ４ ０ ３ Ｅ，购 自梅 特勒一 托 利 多
仪器有限公司 ；康士洁牌数码超声波清洗机 Ｐ Ｌ 一 ￥ ３ ０（ 功
率１ ８ ０ ｗ，频率 ４ ０ ０ ０ ０ Ｈ ｚ ） ，购 自深圳市宸韵 佳贸易有 限 公司；酶标仪 ｓ ｙ ｎ ｅ ｒ ｇ ｙ Ｈ １ ５ ３ ０ ０ ，购 自基因有 限公 司。
总抗 氧化 能力 和 羟 自由基 清 除 能 力测 定 试 剂 盒 ，购 自苏 州科 铭 生物 技术 有 限公 司 。 紫外 可见 分 光 光 度 计 Ｕ 一 ３ ９ ０ ０ ，购 自 日本 日立 公 司 ； 离心 机 ｅ ｐ ｐ ｅ ｎ ８ １ ０ Ｒ，购 自艾 本德 中国有 限
等 ，提取方法常受提取 时间 、温度 、ｐ Ｈ值 、料液 比、 提取次数等 因素 的影响 ，使 得多糖提取率 的高低不 同，
耗费 的 时 间 、物 力 以及 成 本也 不 同。水 提 醇 沉法 是 最 常
用的真菌 多糖提取 方法 ，它操作 简单 ，但存 在着 损失 大 、周期长 、提取率不高等缺点 。超声波技术作为一种
第１ ２期
王晶波等 ：桦褐孔 菌多糖 的提取工艺优 化及抗 氧化活 性评价
４ ７
原理 ： 多糖经乙醇沉淀分离后 ，去除其他可溶性糖及
１ ． ４ ． ２ 不 同料 液 比对粗 多糖提 取 的影响
桦褐孔菌中小分子酚醛类物质的抗氧化活性
桦褐孔菌中的小分子酚醛类物质的抗氧化活性摘要桦褐孔菌是一种药用真菌，他在俄罗斯的民间药方中具有广泛的应用，并且据说对人体的健康具有很多益处，比如说桦褐孔菌具有免疫调节和抗肿瘤活性。
在本研究中，我们将桦褐孔菌的水提取物与其他几种药用真菌（姬松茸，灵芝和桑子菇）的水提取物的抗氧化作用进行了精确地对比，结果发现桦褐孔菌具有最强的过氧化物和羟自由基的清除能力。
然后我们将桦褐孔菌的子实体与菌核分开，分别用80%的甲醇进行提取，结果显示桦褐孔菌子实体的抗氧化能力要远远高于菌核。
最后，我们从桦褐孔菌子实体80%甲醇提取物中分离出了7种抗氧化成分，经过鉴定他们是以下几种小分子的酚醛类物质：4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸乙酯2-羟基-1-羟甲基酯(丁香酸乙酯-2羟基-1-羟甲基酯，BAEE)，原儿茶酸（PCA），咖啡酸（CA），原儿茶醛（DB），2,5-二羟基对苯二甲酸（DTA），丁香酸（SA）和3，4-二羟基苯丁烯（DBL)。
值得注意的是，BAEE是第一次从天然产物中分离并鉴定出来。
桦褐孔菌是一种分布于欧洲高纬度地区，朝鲜和日本的真菌，它通常寄生在白桦树的树枝上，一些黑色的，不成形的桦褐孔菌可以在树干上寄生10--15年，不过大部分的桦褐孔菌还是生长在白桦树的树枝上，也被称为白桦茸，已经被应用于传统的药方之中。
近几年好多文献报道桦褐孔菌具有提升健康的作用，例如，保护DNA免受氧化应激的伤害，抗炎，止疼，抗肿瘤活性等。
然而，除了一些萜类物质外，迄今为止还没有文献报道桦褐孔菌水提取物中活性成分的化学结构。
另一方面，众所周知，氧化应激反应会造成各种各样的疾病，如癌症，高血压，神经性疾病（阿尔茨海默氏症和帕金森氏症），以及一些自身免疫疾病。
因此许多来源于食物等天然产物中的抗氧化性物质被用来治疗疾病。
在这些文献中，提到最多的就是白桦茸的抗氧化特性，尽管由文献报道说桦褐孔菌中的多酚片段具有抗氧化活性，但是这些物质抗氧化的原理仍然少有报道。
桦褐孔菌多糖的硫酸化修饰及生物活性研究
桦褐孔菌多糖的硫酸化修饰及生物活性研究张秋平;徐向群【摘要】研究探讨桦褐孔菌胞内、胞外多糖经过硫酸化修饰后其化学组成与生物活性的变化.利用水溶醇沉法提取了胞外多糖EPS和胞内多糖IPS.以EPS为样品,通过正交实验确定了最佳的硫酸化修饰条件为反应温度75℃,反应时间2.5h,反应摩尔比1∶2.5.在同样修饰条件下,胞外多糖取代度要高于胞内多糖取代度.桦褐孔菌胞内、胞外多糖经硫酸化修饰后,糖含量、蛋白质含量以及糖醛酸含量都有所降低,然而硫酸化修饰多糖展示出了更强的DPPH清除活性以及更低的IC50值.这表明桦褐孔菌胞外、胞内多糖经硫酸化修饰后,有效提高了抗氧化活性,利于其进一步开发利用.【期刊名称】《浙江理工大学学报》【年(卷),期】2016(035)005【总页数】5页(P754-758)【关键词】桦褐孔菌;多糖;硫酸化修饰;抗氧化活性【作者】张秋平;徐向群【作者单位】浙江理工大学理学院,杭州310018;浙江理工大学理学院,杭州310018【正文语种】中文【中图分类】Q538桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属于担子菌亚门，是一种非常珍稀且有着良好治疗效果的可食药用真菌，主要分布在北纬45°～50°的寒冷地区，如欧洲、亚洲和北美地区，是生长在寒带的木腐菌[1]。
桦褐孔菌多糖是其主要的活性组分，有着多种生物功能，如抗肿瘤、抗氧化和免疫调节活性[2-4]。
野生桦褐孔菌资源非常昂贵且稀缺。
我们实验室研究报道了通过液体深层发酵桦褐孔菌能获得更多含量以及更高活性的胞外多糖[5-6]，然而，桦褐孔菌多糖的溶解度偏低，从而影响其生物活性的发挥。
多糖的生物活性与其结构有着密切的关系，对多糖结构进行适当修饰是多糖领域研究的重点方向之一。
多糖经硫酸化修饰后，不仅能加强其溶解性，而且能够改变多糖的结构，从而导致多糖生物活性的加强甚至产生新的生物活性[7-8]。
一些研究报道了硫酸化修饰多糖展示了更强的抗氧化以及抗肿瘤活性[9]，而对桦褐孔菌多糖硫酸化修饰的报道却很少。
桦褐孔菌抗氧化活性物的稳定性研究
酸钾 ； 甲酸钠 均 为分 析纯 。 苯 １ 主 要仪器 ． ２
紫外可见分光光度计 ： 尤尼柯 （ 上海 ） 仪器有限 公 司， ｖ ２０ ；恒温水浴锅 ：金坛市科兴仪器厂 ， ｕ 一 ００ Ｈ — ；真空泵 ：河南 省巩义市英峪 中华仪器 厂 ， Ｈｌ Ｓ Ｚ ３酸度计 ： Ｈ 一； 上海 大普仪器有 限公司 ，Ｈ 一 ５ ； Ｐ Ｓ ２Ｂ 紫外线发射源。
１ 提 取 方法 ． ３
及时清除这些 自由基 ， 是强体防病 、 延年益寿的有效
途径 之一 。寻 找对 自由基具 有 良好清 除 能力 的清 除
剂， 特别是从常见的食品资源 中进行筛选 ， 是一个非
常重要 的研 究课 题 。
本 实验 旨在研究桦褐孔菌 提取 物在不 同条件 （Ｈ值 、 ｐ 温度 、 紫外线照射时间 、 放置时间 、 常用食品 添加剂 ） 下对清除 自由基能力的影响。
１ 材料 与 方法
称取桦褐孔菌 ２ ， ８ Ｌ ８ 用 ０ ％的乙醇在 ７ ℃ ｇ ｍ ４ ５
的水 浴锅 中浸提 ５ ｎ ０ｍｉ。乙醇提 取液 经旋 转蒸发 仪
进行 真空浓缩， 同时 回收乙醇 ， 乙醇完全蒸出 ， 待 最
后将得 到桦褐孔菌粗提物用蒸馏水定容至 ４ Ｌ ０ｍ ，
（ ｅ ａｔ ｅ ｔ ｆ ｏｄａ ｄＢｏ ｇｃｌ ｎ ｉｅｒ ｇ ｈ ｎ ｚｏ ｎｖ ｒ ｔ ｏ ｉｈ Ｉｄ ｓ ｙ ｈ ｎｚ ｏ Ｄ ｐ ｒ ｎ ｏ ｎ ｉ ｏ ｉ ｇｎ ｅｉ ， ｅ ｇｈ ｕＵ ｉ ｓ ｙ ｆ ｇ ｔ ｎ ｕｔ ， ｅ ｇｈｕ ｍ ｏＦ ｌ ａＥ ｎＺ ｅ ｉ Ｌ ｒＺ ４ ０ ０ ， ｎ ｎ Ｃ ｉａ ５ ０ ２ Ｈｅ ａ ， ｈｎ ）
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桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰及其抗氧化活性邵珠领;吴艳丽;张宇;王宇亮;赵宏;赵芷萌【摘要】采用乙酰化修饰方法对桦褐孔菌多糖进行结构修饰,并评价其抗氧化活性,为桦褐孔菌多糖结构修饰提供新的思路和方向.以桦褐孔菌为原料,采用水提醇沉法提取桦褐孔菌多糖,过AB-8大孔吸附树脂,得纯化后的桦褐孔菌多糖.在氢氧化钠水溶液中以不同体积的乙酸酐制备乙酰化桦褐孔菌多糖,盐酸羟胺比色法测定其取代度.在此基础上,对3种不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖进行抗氧化活性研究.结果表明,桦褐孔菌多糖经纯化后,通过乙酰化修饰得到三个取代度分别为0.2810、0.3136、0.4072的乙酰化产物,随着乙酰化试剂的体积增加,多糖取代度逐渐增大;三个不同取代度的乙酰化产物对DPPH自由基最大清除率分别为71.8％、74.9％、78.5％;对超氧阴离子的最大清除率分别为71.8％、74.9％、78.5％;对羟基自由基的最大清除率分别为74.5％、79.9％、81.1％.随着取代度的增加,乙酰化桦褐孔菌多糖抗氧化活性逐渐增强.桦褐孔菌多糖经乙酰化修饰后,可显著提高体外抗氧化活性,且抗氧化活性的强弱与乙酰基取代度有关.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)009【总页数】5页(P73-77)【关键词】桦褐孔菌;多糖;乙酰化;抗氧化活性【作者】邵珠领;吴艳丽;张宇;王宇亮;赵宏;赵芷萌【作者单位】黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;生命科学与环境科学研究中心,哈尔滨商业大学,黑龙江哈尔滨150070;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;黑龙江省新药创制与药效毒理评价重点实验室,佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】TS201.1桦褐孔菌Inonotus obliquus(Fr.)Pilat属担子菌亚门层菌纲锈革孔菌目锈革菌科褐卧孔菌属[1]。
桦褐孔菌主要分布在北半球北纬 40～50°的地区,如北美(北部)、芬兰、波兰、俄罗斯(西西伯利亚、远东部分地区、堪察加半岛)、日本北海道等国家和地区[2]。
我国桦褐孔菌主要分布在吉林长白山地区、黑龙江大小兴安岭以及内蒙古等地[3]。
桦褐孔菌具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗寄生虫等多种药理活性,而其大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关[4]。
多糖结构的化学修饰主要是利用多糖分子中的羟基、羧基、氨基等活性基团进行化学反应以引入新的基团,如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等[5]。
多糖的乙酰化是一种重要的多糖修饰方法。
乙酰基的引入使分子的伸展状态发生变化,导致多糖极性基团暴露,增加了多糖在水中的溶解性,同时乙酰基的数量和位置对多糖活性也有显著影响[6]。
真菌多糖的生物活性与其结构密切相关,经化学修饰后,可能会提高多糖抗氧化、降血糖等作用[7-8]。
杨春瑜等研究发现,对黑木耳多糖进行乙酰化修饰后,其抗氧化活性增加[9]。
李淑琴等研究表明,乙酰化乌龙茶多糖溶解性增强,还原活性显著提高[10]。
目前的文献对研究桦褐孔菌多糖的研究主要集中在提取分离等方面[11-12],关于其乙酰化修饰及其修饰后活性的研究还未见报道。
因此,本文以乙酸酐作为酰化试剂，对提取纯化后的桦褐孔菌多糖进行乙酰化修饰，并评价其抗氧化活性,为桦褐孔菌多糖抗氧化活性的构效关系研究和资源开发利用提供参考。
1 材料与方法1.1 材料与仪器桦褐孔菌购自黑龙江省佳木斯市亮子河山特产店；苯酚、氢氧化钠、浓盐酸、盐酸羟胺、三氯化铁、无水乙酸钠、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸、乙酸酐、无水乙醇均为国产分析纯;葡萄糖、氯化乙酰胆碱购自阿拉丁生化科技股份有限公司;透析袋Mw3000 购自源叶生物科技有限公司。
FDU-1200冷冻干燥机日本东京理化;RE-2000A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;DL-5-B 低速多管离心机上海安亭科学仪器厂;765紫外可见分光光度计上海仪电科学仪器股份有限公司;DBS100 自动馏分收集器上海嘉鹏科技有限公司;Vortex-1/2 涡旋混合器上海沪西分析仪器厂有限公司。
1.2 实验方法1.2.1 桦褐孔菌多糖的提取桦褐孔菌菌体粉碎后过80目筛,25 ℃条件下用95%乙醇浸泡1 d,减压过滤,滤饼(半径:7 cm,高:3 cm)50 ℃烘干24 h后备用。
取一定量烘干后的桦褐孔菌滤饼加入5倍体积的双蒸水95 ℃浸提3 h[11],过八层纱布保留滤液,滤渣重复提取一次,合并滤液,减压浓缩。
浓缩液加入一定量的乙醇,使乙醇浓度达到80%,充分搅拌后放入4 ℃冰箱中醇沉12 h。
25 ℃,4000 r/min离心10 min,收集沉淀,依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤沉淀3次,130 Pa 45 ℃真空干燥12 h后得到桦褐孔菌粗多糖。
按照以下公式来计算桦褐孔菌多糖的得率。
得率1.2.2 桦褐孔菌多糖的纯化取真空干燥后的桦褐孔菌粗多糖适量,使用双蒸水配制成10%多糖溶液,按体积比1∶4加入Sevag试剂,充分振荡30 min后静置4 h。
4000 r/min 25 ℃离心15 min,弃去下层蛋白,重复上述操作,紫外扫描检测,直至桦褐孔菌多糖溶液在260和280 nm波长处无明显紫外吸收,表示溶液中游离蛋白质类杂质已除尽。
将脱蛋白后的多糖溶液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后冷冻干燥,得到桦褐孔菌粗多糖。
取5 g脱蛋白的桦褐孔菌粗多糖溶于10 mL双蒸水中,4000 r/min 25 ℃离心15 min后,取上清液在已准备好的AB-8大孔树脂柱上进行上样。
吸附24 h后用双蒸水进行洗脱,自动馏分收集器收集洗脱液,采用苯酚-硫酸法在490 nm波长(紫外可见分光光度计)隔管检测吸光度,合并洗脱液。
洗脱液55 ℃条件下减压浓缩至原溶液1/3后透析(44 mm),冷冻干燥得到纯化后的桦褐孔菌纯化多糖。
纯化后的桦褐孔菌多糖以D-葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定其总糖含量。
1.2.3 桦褐孔菌多糖的乙酰化修饰取0.5 g桦褐孔菌纯化多糖溶于10 mL三蒸水中,用3%的氢氧化钠调节溶液pH至11.0。
30 ℃油浴下,分别交替加入氢氧化钠溶液和乙酸酐各1 mL,控制反应溶液pH在7.0～11.0,直至加完乙酸酐。
30 ℃条件下维持搅拌3 h(pH=8)。
反应结束后,用1 mol/L盐酸中和反应溶液(pH=7),将反应液置于自来水中透析48 h,三蒸水中透析24 h。
将透析液减压浓缩,冷冻干燥后得到乙酰化桦褐孔菌多糖[13]。
另取两份相同量的桦褐孔菌纯化多糖,加入乙酸酐的量分别为2、3 mL,其余实验条件不变。
1.2.4 傅里叶红外光谱分析取纯化桦褐孔菌多糖与加入1 mL乙酸酐乙酰化后得到的桦褐孔菌多糖各2 mg,采用溴化钾压片法,使用傅里叶红外光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行光谱扫描。
1.2.5 乙酰基取代度的测定1.2.5.1 标准曲线的绘制用0.001 mol/L醋酸钠溶液将氯化乙酰胆碱标准品配制成浓度为1.064 mg/mL的溶液。
精密移取氯化乙酰胆碱标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于试管中,加水至1 mL,加入2 mL碱性羟胺溶液,涡旋混合器混合均匀,于25 ℃放置4 min,加入1 mL 4 mol/L盐酸(pH为1.2±0.2),加入1 mL 0.37 mol/L三氯化铁-盐酸溶液,摇匀后在540 nm波长测定其吸光度。
同步做上述各个标准系列溶液的空白对照,先加入盐酸后加入碱性羟胺,其余步骤与上述相同。
1.2.5.2 取代度测定取桦褐孔菌多糖乙酰化溶液1 mL按照标准溶液的操作方法进行测定。
根据标准曲线得到乙酰化桦褐孔菌多糖的乙酰基质量M1,按照以下公式计算出三个不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖的取代度[14]。
乙酰基百分含量(W,%)=M1/M2×100取代度式中：M1-乙酰化桦褐孔菌多糖中乙酰基的质量(mg);M2-乙酰化桦褐孔菌多糖的质量(mg);162-葡萄糖相对分子质量;43-乙酰基相对分子质量;1-氢原子相对原子质量。
1.2.6 体外抗氧化活性研究1.2.6.1 DPPH自由基清除率的测定取3种不同取代度,不同浓度的桦褐孔菌乙酰化多糖及纯化后桦褐孔菌多糖样品溶液3 mL,加入新鲜配制的DPPH-乙醇溶液1 mL,涡旋混合器混合10秒,25 ℃水浴避光反应30 min,在517 nm处测定吸光度;以VC为阳性对照,同时测定空白组(样品不加DPPH)和阳性对照组样品吸光度。
按如下公式计算对DPPH自由基清除率。
DPPH·清除率(%)=1-(A1-A2)/A0)×100式中:A0-无样品溶液吸光度值；A1-样品溶液的吸光度值;A2-无DPPH样品溶液的吸光度值。
1.2.6.2 超氧阴离子清除率的测定在试管中分别加入3 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液及不同浓度的桦褐孔菌多糖和不同浓度、不同取代度的乙酰化桦褐孔菌多糖,25 ℃水浴10 min。
加入0.03 mol/L预热的邻苯三酚12 μL反应4 min。
在320 nm处测吸光度。
Tris-HCl溶液和VC分别作为空白和阳性对照组。
按以下公式来计算超氧阴离子清除率(%)。
清除率(%)=(A1-A2)/(A1-A0)×100式中:A0-Tris-HCI溶液吸光值;A1-不加样品的Tris-HCI和邻苯三酚溶液的吸光度;A2-样品溶液的吸光度。
1.2.6.3 羟基自由基清除率的测定在试管中依次加入不同浓度、不同取代度的三种乙酰化桦褐孔菌多糖及桦褐孔菌多糖样品溶液1 mL、0.75 mmol/L邻菲罗啉溶液1 mL、0.75 mmol/L硫酸亚铁1 mL、0.01%双氧水1 mL、0.15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.4)1.5 mL混匀,室温静置10 min,37 ℃加热1 h,在536 nm波长处测吸光度。
蒸馏水和VC分别作为空白对照和阳性对照,按以下公式来计算羟自由基(·OH)的清除率(%)。
·OH清除率(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100式中:A0-空白组样品溶液吸光值;A1-样品溶液吸光度值;A2-对照品溶液的吸光度(双氧水和样品溶液用蒸馏水来代替)。
1.3 数据分析以上实验均平行进行3次,所得数据经SPSS 19.0 处理,使用Duncan’s检验分析显著性,p<0.05表示差异显著。