石蜡切片法

一、 二、 三、 四、 五、 六、 七、
取材 固定 浸洗（冲洗） 脱水 透明 浸蜡（透蜡） 包埋
八、 切片 九、 展片和贴片（裱片） 十、 烤片 十一、 染色 十二、 封固（封片） 十三、 贴标签
一、取材
1、用锐利刀、剪剪切组织块，不可来回切割和 用力挤、压，以免损伤组织。 2、组织块大小一般为5×5×2mm。 3、切好的组织块经生理盐水清洗后可用牙签
十、 烤片 1、展片时是利用水使切片展平，但载玻片 与蜡片之间尚留有部分水分，烤干便是将水分 通过温箱加热后除去，使组织在脱蜡后依然能 够粘贴在载玻片上。若水分未烤干，则脱蜡时 组织会脱落。 2、烤干时的温度<60℃，一般以50℃较为 适当；也可置37℃温箱内烤干（约12~24hr，烤 干后蜡片在玻片上呈透明状）。烤干的时间， 以底烤去水分为原则。
四、切片发生严重皱纹： （1）蜡太软、室温过高→用冰块冰一下再切； （2）切片刀不锋利→磨刀； （3）刀的切削角过小→切刀片仅能在蜡块切削面上浮切 →改变切削角 五、蜡片裂纹： （1）切片刀口缺口刀纹； （2）刀刃不干净→干布擦； （3）蜡块中具有坚硬杂质或尘埃：石蜡过滤及修块时用
刀削去各个方面的表面蜡（纸屑）。
十三、 贴标签 切片封后，在切片的右侧贴上标签， 平放于无灰尘或放在左右的温箱中烤几天 ，待树胶干固后便可使用。 如制成的切片上，树胶过多而溢出盖 片，则可候其完全干固后，用刀片轻轻刮 去，再用纸蘸二甲苯少许将胶擦净。
七、包埋 1、目的：使组织与石蜡在硬度上适配， 以利于切片。 2、硬蜡包埋温度65℃。 3、包埋操作要快，材料吸、夹入石蜡后 轻吹使蜡表面凝结成薄膜状，即可将 其没入水中使快速、均匀、完全凝固
八、切片 1、单面刀片修整蜡块，长：宽约3：2，长边与 刀刃平行。 2、木块上先熔上一点蜡，再用烫蜡铲将蜡块牢固 地粘在木块上；之后沿蜡块四周用烧热的解剖 针烫几下，使蜡块粘牢。 3、安装，刀口与蜡块的角度<100。 4、切片：5~8m；左手用毛笔托住蜡带， 右手不断摇动切片机，获连续切片。 5、切片前，将蜡块置冰箱冷藏一下； 较硬、难切的材料，可将蜡块在甘油：50%酒 精=1：1液中半浸泡数天再进行切片。
十一、 染色
1、原理： （1） 物理作用即渗透和吸附等； （2） 化学作用： 细胞核呈酸性，易于为碱性染料（氧化苏木精） 着色； 细胞质呈碱性，易于为酸性染料（伊红）着色； 核仁一般呈碱性（大量组蛋白和少量 RNA），为 酸性染料（伊红）着色。 2、染色液： （1）氧化苏木精：已配 （2）伊红：0.1~1%的酒精溶液，95%酒精配制
挑起放入固定液，不可用镊子夹以防
组织块被损伤。 4、软组织不易切小或易变形组织不宜切小， 可先取稍大的组织块固定2~3小时，待 组织块稍变硬后再修切成薄的小块继续固定。
二、 固定 1、目的：保持细胞生活时的形态、结构，使细胞内各成分 （如蛋白质、糖等）沉淀保存下来而与生活时相仿；防 组织自溶和腐败；助染及造成折光率差异；硬化作用。 2、Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液 75 ml 甲醛（40%） 25 ml 冰乙酸 5 ml
六、切片厚薄不匀： （1） 加滑油；（2）螺丝要柠紧；（3）切削角不适宜。
七、切片中组织与蜡分离：透蜡不足，从新浸蜡、包埋。
九、 展片和贴片（裱片） 1、清洗玻片：95%酒精（或95%酒精和盐酸20：1浸泡一夜 除油污，用水冲洗后放入95%酒精）浸泡数小时后用白细布擦干 备用。 2、粘片剂——蛋白甘油： 新鲜蛋白25ml+甘油25 ml+0.5g麝香草酚或石炭酸→100 ml 量筒中，用力振荡使成泡沫→纱布过滤，储存于玻璃瓶中 1~2月 ；使用原液或用蒸馏水1：1稀释后再用。 3、操作：取洁净玻片→用手指抹上一薄层粘贴剂于玻片中 间成一薄层→滴加数滴DW→用刀片切取蜡带选择合适段落，切 片按序自上而下，自左而右排成几行，两端排齐（面积<S盖玻片） →将蜡片放于玻片水面上（蜡带背面较亮、光滑，正面较暗、粗 糙→应将背面与玻面接触，便于展平和贴紧）→将带有蜡片的玻 片放于展片台上，蜡片因受热而伸展（但勿加热过度，使蜡条熔 化，损坏组织；蜡下有气泡必须除去）→展平后用解剖针把蜡片 固定于合适位置上→倾去多余水待切片干后（防蜡片随水倒去） →烤干。
3、染色过程： 二甲苯Ⅰ2~5min→二甲苯Ⅱ2~5min→酒精：二甲苯（1：1 ）5min→100%酒精2min→95%酒精2min→90%酒精2min→80%酒 精2min→70%酒精2min→50%酒精2min→DW2min→苏木精染色 8~15min→自来水冲洗15min，防脱落→50%酒精2min→70%酒精 2min→80%酒精2min→90%酒精2min→0.5%的伊红溶液（95%酒 精配制）数秒~1min→95%酒精Ⅰ2min→95%酒精Ⅱ2min→100% 酒精Ⅰ2min→100%酒精Ⅱ2min→酒精：二甲苯（1：1）2min→ 二甲苯Ⅰ2min→二甲苯Ⅱ2min 4、酒精和二甲苯使用时间过久，浓度会下降，应更换新液 。更换各级酒精时，无须全部更换。可将各级酒精或二甲苯依次 降一级使用，如将第一缸95%酒精降为90%酒精、第二缸无水酒 精降为第一缸无水酒精，那么只要将第二缸无水酒精更换成新液 即可。
(1)95%与100%二级中<2hr，以防组织变硬、脆化；
（2）盛纯酒精的缸子的盖子边缘可涂一层凡士林以防吸收 空气中的水分； （3）纯酒精中如有水分用灰白无水CuSO4(滤纸包卷)吸去。 （4）脱水过程如需过夜应停留于70%酒精中。
五、 透明 1、二甲苯作脱水剂和石蜡的媒介，取代酒精，便 于石蜡渗入组织，利于包埋、切片且能与封片 树胶相混合。 2、透明时间≤30~45min，以防组织强烈收缩、 变硬和变脆。 3、过程：酒精：二甲苯（1：1）10~20min→ 二甲苯Ⅰ10~15min→二甲苯Ⅱ10~15min →二甲苯Ⅲ10~15min→透明为止 4、脱水兼透明：叔丁醇或正丁醇 防组织收缩、脆硬， 适用于较成熟的卵巢组织。
6、质量分析及改正
一、不能形成连续带：
（1） 长：宽=3：2；
（2）注意切片厚度选择； （3）室温过低（如8℃以下）→加台灯； （4）石蜡过硬→加削面不平行（非长方形）→使平行且相等； （2）长边与刀刃不平行 三、蜡片粘附于切片上： （1）室温高（>35℃）； （2）切刀刃残留二甲苯、液体石蜡等。
（1）苦味酸（三硝基苯酚）黄色、剧毒、强酸性、自燃、自爆，故配成溶液保存 （2）苦味酸可沉淀一切蛋白质，对类脂和糖无作用 （3）使用前配置 （4）金属器械不能接触固定液。
3、固定时间：1 mm厚组织块 2~12小时 2 mm厚组织块 12~24小时 4、体积比>100；且须常摇动 防沉底、粘壁产生固定不均匀现象。 5、避光固定；不同的材料最好分瓶固定；固定瓶上贴标签。
三、浸洗（冲洗） 1、目的：洗去过剩的固定液， 防沉渍。
2、Bouin’s液固定的材料直接用 70%的酒精洗数次，以洗去黄 色；千万不能用水洗，防胶原 纤维膨胀而使组织疏离。
四、 脱水
1、目的：浸洗后的组织块含有部分水分，而水与透明剂不能 相混合，故必须彻底脱水以利于组织透明与浸蜡。 2、过程：酒精逐级脱水(45~60 min)以避免组织过度收缩。 70%→80%→90%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%Ⅰ→100%Ⅱ
六、 浸蜡（透蜡） 1、目的：以石蜡取代透明剂二甲苯，使组织中的一切空隙 为石蜡透入而填满。 2、过程：二甲苯：石蜡（1：1或分级25%、50%、70% 石蜡）20~30min→石蜡Ⅰ45~60min→ 石蜡Ⅱ45~60min→石蜡Ⅲ45~60min 3、温度要恒定，一般比石蜡熔点高2~3℃ 4、石蜡：（1）旧蜡比新蜡好； （2）新蜡要长时间煎炼以除去杂质气体，直至呈 黄色、质地细腻而柔和； （3）旧蜡中含二甲苯要加热使其蒸发干净； （4）必要时添加5~10%蜂蜡以增加石蜡韧度。 5、软蜡（42~50℃）和硬蜡（52~58℃）： 组织硬、切片薄、室温高→用硬蜡 组织软、切片厚、室温低→用软蜡
5、操作要快防切片在空气中停留过长。
十二、 封固（封片） 把切片由二甲苯中取出，用布或纸把组织 四周多余的二甲苯擦去。滴一滴树胶在组织上 ，加盖盖玻片。 树胶浓度要合适，多少也要恰当。如果树 胶滴得太多，不仅浪费，封固后也不美观；滴 得太少，会在盖玻片与载玻片之间留有空隙。 加盖盖玻片时要倾斜地由左边开始盖在树 胶与组织上，慢慢向下放平，这样才不会出现 气泡。