分子标记
分子标记技术
探针的标记(labeling)
利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针 进行标记，以跟踪探针。
同位素标记：利用DNA聚合酶 （Klenow），在DNA复制的过程中，把32PdCTP合成到DNA片段上。
预杂交
杂交液 + 鲑精DNA ( sheared salmon sperm DNA, SSS DNA )
基本原理
采用随机合成的寡核苷酸（通常10bp）作 PCR反应的引物，对所研究生物基因组DNA进 行PCR扩增，经过30－40个循环，即可得到大 量的DNA片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 EB染色、紫外下显示RAPD带纹。
❖ 由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须 对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向 重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。 引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之 间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片 段数目和长度的差异，导致PCR产物增加、缺少 或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则 产生RAPD标记。
三、DNA分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可 分为三大类。
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括：
★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）；
★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
电泳
电泳用的凝胶由琼脂糖（agarose）制备， 琼脂糖的浓度通常为0.9-1.0%。
酶切后的DNA样品通过电泳，使DNA片段 分离,并按分子量的大小排列。
分子标记技术
多组学数据整合
采用降维技术对高维数据进行处理，如主成分分析、t-SNE等，以降低数据复杂度并提高可视化效果。
数据降维处理
结合多种分析方法对整合后的数据进行联合分析，如聚类分析、差异表达分析、功能注释等，以深入挖掘数据中的生物学意义。
02
CHAPTER
DNA分子标记方法
利用随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，通过电泳等方法检测扩增产物多态性。
原理
特点
应用
实验操作简便、快速、成本低，但稳定性较差，重复性有待提高。
适用于遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位等研究。
03
02
01
基于DNA单链在非变性条件下的构象多态性，通过电泳等方法检测不同构象的DNA单链。
前景展望
随着基因组学、转录组学等高通量测序技术的不断发展，未来分子标记技术将更加精准、高效和便捷。同时，随着人工智能和大数据技术的融合应用，分子标记技术将在更多领域发挥重要作用，如精准医疗、个性化治疗、生态环境监测等。此外，随着合成生物学和基因编辑技术的不断发展，利用分子标记技术进行基因定位和编辑将成为可能，这将为遗传性疾病的治疗和农作物遗传改良提供新的思路和方法。
原理
微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）是两类重要的非编码RNA，它们在基因表达调控中发挥关键作用。miRNA通过靶向mRNA导致其降解或抑制其翻译来发挥作用，而lncRNA则通过多种机制调节基因表达。
原理
miRNA和lncRNA作为分子标记在疾病诊断、预后评估和治疗靶点筛选等方面具有潜在应用价值。例如，在癌症研究中，特定miRNA或lncRNA的表达水平与癌症的发生、发展和转移密切相关，可作为癌症诊断和治疗的生物标志物。此外，miRNA和lncRNA还可用于研究细胞分化、发育和逆境胁迫等生物学过程。
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
综述-分子标记
分子标记遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。
遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。
形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。
虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。
从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。
一、分子标记的概念分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。
广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。
而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。
二、分子标记的特点理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。
目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。
三、分子标记的分类分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。
分子标记
分子标记分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。
分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。
植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。
②不受环境影响。
因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。
③标记数量多,遍及整个基因组。
④多态性高,自然存在许多等位变异。
⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。
⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1. 1 第1 代分子标记1.1. 1 RFLP 标记技术。
1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。
RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。
优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。
缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。
分子标记
1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。
SCAR标记是在RAPD技术基础上发展起来的。SCAR标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增，把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。
① 随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )
RAPD技术是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
分子标记
RFLP标记多态性的分子基础
Southern blotting
RFLP实验流程
移
自显影
RFLP 图谱
RFLP
显性标记 or
共显性标记
RFLP的应用：
1. 分类及遗传多样性研究
2. 遗传图谱的建立
遗传图谱(genetic map)指某一物种的染色体图谱(即连锁图谱)，
分子标记 Molecular Marker
遗传标记
遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 1. 形态标记
形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、
穗形、粒色或芒毛等的相对差异。形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的 外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
2. 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的
第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。如：SNP标记。它是由DNA序列中因单个碱 基的变异而引起的遗传多态性。目前SNP标记一般通过DNA芯片技术进行分析。
DNA标记多态性分子基础示意图
分子标记的类型
① 基于杂交的分子标记，如RFLP（Restriction
fragment length polymorphism,即限制性长度片
Southern杂交技术才能够检测到。可见，要进行RFLP分析首先要
分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分 析。 RFLP标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点。 但RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标
记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力
随机引物PCR产物多态性的分子基础
类型1为显性标记，是最常见的多态 性，类型2、3、4为共显性标记，但 较少见
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7
4 分子标记种类
1
以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
2
以PCR技术和电泳技术为基础的分子标记
3
以DNA序列为基础的分子标记
8
4 分子标记种类
1. 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 限制性片段长度多态性 VNTR (Variable Number Tandem Repeat) 可变数目串连重复位点 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 荧光原位杂交 GISH (Genomic In Situ Hybridization) 基因组原位杂交
4
2. 遗传标记
生化标记（biochemical marker） 20世纪初 种子贮藏蛋白
品种鉴定 转化为PCR标记遗传多态性
同工酶 共显性遗传 品种指纹分析
位点数量不够 基因表达的组织特异性
5
2. 遗传标记
DNA分子标记 20世纪80年代后期 分子标记概念的界定
广义: 指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的 酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶 的不同分子形式） 狭义: 指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳
优点
缺点
肉眼可见、直观方便
数量少 多态性差 易受环境条件影响 有些标记对农艺性状有不利影响
3
2. 遗传标记
细胞学标记（cytological marker） 染色体数目变化 缺体 单体 三体 端体 等 染色体结构变异 缺失 易位 等 染色体分带 C G N带 缺点： 必需以熟练的细胞学技术作为支撑
9
4 分子标记种类
2. 以PCR技术和电泳技术为基础的分子标记
RAPD：随机扩增多态DNA (Random Amplified Polymorphic DNA) AP-PCR：任意引物PCR (Arbitrary primed PCR) DAF ：DNA扩增指纹（DNA Amplification Fingerprinting） STS：序列标签位点 (Sequence Tagged Site) SSR: 微卫星(Simple Sequence Repeat) SSLP(Simple Sequence Length Polymorphism) SCAR：序列特异扩增区域 (Sequence Charactered Amplified Region) SPAR：单引物扩增反应 (Single Primer Amplification Reaction) SSCP：单链构象多态性 (Single Strand Conformation Polymorphism) ddF:双脱氧指纹法（Dideoxy Fingerprints, ddF) \ ISSR: 微卫星间DNA多态性(Inter-Simple Sequence Repeat) RAMP：随机微卫星扩增多态性 (Random Microsatellite Amplified Polymorphism) AFLP：扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism) CAPS：剪切扩增多态性 (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences) dCAPS：酶切特异扩增多态性 (Digested Character Amplified polymorphism sequences)
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 随机引物标记法 利用随机引物作为合成 DNA 探针的引物，通常是6个核苷酸 的寡聚核苷酸片段。这些寡聚核 苷酸片段包含了各种可能的排列 顺序，因此它们中总有一些片段 可结合到模板（探针）分子上去 充当引物。在DNA聚合酶的作用 下合成探针片段 这些片段一般比原模板短， 但由于合成片段多，因而标记效 果好
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
DNA分子杂交：变性的双链DNA分子和带有互补性顺序的同源单链间的配对过程 探针：指经过放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列（通 常是与某DNA或RNA片段序列相同或相近的一段同源序列） 基因组DNA限制性酶切产生的酶切片段、利用基因克隆和细菌精确复制能力 获得大量单一的DDNA克隆、反转录DNA(cDNA)克隆、随机 的基因组DNA克隆、合成的特殊低聚核苷酸克隆、重复序列或多拷贝序列等 Southern blotting: 将电泳凝胶上的DNA直接转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上 的技术，用DNA探针与固定在膜上的DNA片段进行杂交再通过放射自显影（或特 殊检测手段）获得分子杂交的结果
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
1. RFLP标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)
称为限制性片段长度多态性,发展最早的DNA标记技术,1974年Grodzicker 等创立,是一种以DNA/DNA杂交为基础的第一代遗传标记 RFLP基本原理： 利用特定限制性内切酶酶切基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，DNA片 段数目和各片段的长度反应了DNA分子上不同酶切位点的分布情况；通过凝胶 电泳分析这些片段形成不同带，然后与克隆的DNA探针进行Southern杂交和放 射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱
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5
以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
RFLP技术主要基本步骤：
DNA提取
凝胶电泳分开 DNA片段
放射性标记 探针杂交 (Southern杂交)
限制性内切酶 酶切DNA
转移DNA片段 到支持膜上
显示特定的 DNA片段差异
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5
以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
2. 数目可变串联重复多态性 (Variable Number of Tandem Repeats，VNTR) 又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复DNA小序列，为十到几 百bp，拷贝数10～10001不等。 基本原理：与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求 (1)限制性内切酶切点不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性 (2)限制性内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片 段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。 (3)分子杂交所用DNA探针必须是小卫星或微卫星序列，通过分子杂交和放射自 显影后，可一次性检测多个小卫星或微卫星位点，得到个体特异性DNA指纹图谱 优点：多态信息含量较高(17～19) 缺点：数量有限，且在基因组上分布不均匀 实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
3. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) ：荧光原位杂交 4. GISH (Genomic In Situ Hybridization)：基因组原位杂交 植物染色体原位杂交 基本原理： 根据核酸分子碱基互补配对原则（A-T、A-U、G-C)将放射性或非放射性 的外源核酸（探针，Probe)与染色体上经过变性的单链DNA在适宜条件下互 补配对，结合形成专一的核酸杂交分子，再经过相应的检测手段将待测核酸 在染色体上的位臵显示出来
植物分子生物学实验技术
颜泽洪
1
第三部分 主要分子标记
1 遗传标记及其发展 形态学标记 Morphological marker 细胞学标记 Cytological marker
生化标记 Biochemical marker
分子标记 Molecular marker
2
2.遗传标记
形态学标记（morphological marker) 20世纪前 主要是一些表观上易于识别的性状 如植物的植株高度、花色等
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 缺口平移法(Nick translation) 制备放射性DNA探针的产用方法 以DNA酶消化双链DNA，得到 具有许多缺口的双链DNA。DNA聚 合酶I的5’-3’聚合作用能在缺口 的3’末端加入32P标记核苷酸并使 链得以延伸，该酶又具有5’-3’的 外切活性，能从缺口的5’末端去 掉核苷酸，这样缺口的两端一边 加入32P标记核苷酸，一边切割原 DNA链上的核苷酸，最后得到小片 段的放射性探针 可标记任何DNA,但在某些条 件下可导致DNA分子的剪切降解
缺口平移原理示意图
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
酶标系统标记法 末端标记法(End filling) 利用Klenow酶的催化活性，在粘性末端处合成互补链（即填补粘性末 端），从而达到标记放射性核素的目的 很少剪切DNA分子，但无法标记平末端DNA
末端填补法原理示意图 PCR标记法 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记的dNTP，这样标记的dNTP就 可在PCR反应的同时掺人到新合成的DNA链上
随机引物标记法原理示意图
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5 以分子杂交和电泳技术为基础的分子标记
化学标记法 2-乙酰基芴标记法：利用N-乙酰基-2-乙酰基芴(N-ACO-AAF)与核酸进行反应，将AAF(2-乙 酰基芴)引入到DNA中，主要引入位点在鸟嘌呤的C-8位点，简单、快速、可生成稳定探针， 但2-乙酰基芴有毒，是致癌物质，使应用受到限制 硫代物标记法：通过硫代物在胞嘧啶C-6位点插入，单链的探针即得到标记，该反应在亚硫 酸氢钠催化下进行，约有10-15%的胞嘧啶被硫代 汞标记法：通过汞在胞嘧啶C-6位点位点渗入而使DNA得到标记，汞的毒性限制了应用 光亲和素标记法：用对光敏感的复合物如光亲和生物素、光亲和地高辛对探针DNA进行标记 引物原位标记法 引物原位标记法：先用一个特定的序列与靶序列杂交，然后在DNA聚合酶或反转录酶的作 用下，将已经的杂交的DNA作为标记的核苷酸原位渗入的引物进行标记的一种方法 克隆的DNA， 合成的寡核苷酸、PCR扩增的DNA均可作为原位标记反应的底物