医学免疫学 沉淀反应
医学免疫学 沉淀反应
成对孔
Ag
Ab A B C D E F
应用
定性：沉淀线的有无
相对浓度：沉淀线的位置（靠近浓度小的一侧） 相对扩散率：沉淀线的形状（弯向扩散慢的一侧）
三角形孔
Ab Ag1 Ab Ag1 Ab
Ag1
Ag2
Ag2
Ag2
沉淀线吻合：两种 抗原完全相同
沉淀线相交：两种 抗原完全不同
沉淀线相切：两种抗 原之间部分相同
凝胶的制备
• 原料 – 固体粉末（琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺） – 电解质液 • 过程 按要求把一定比例（1%）的固体粉末与电解质液混 合，加热助溶，冷却，形成具有三维空间网孔的半固体结构 • 性质 – 实为流动的液相 – 网孔的大小与凝胶的浓度成反比 – 小分子的颗粒在凝胶中自由运动，动力来源于物质的浓 度差，而大分子物质的运动则受到网孔的限制
沉淀反应
基本概念
• 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应生成沉 淀物 • 特点 – 反应物可溶（溶液） – 生成物为沉淀（抗原抗体均为多价，相互结合，形成空 间网格，体积变大而从溶液中析出） – 抗原抗体的比例对试验现象的影响明显 • 类型
液相沉淀试验
反应场所 检测方法
凝胶扩散试验 凝胶免疫电泳试验
单向琼脂扩散试验
• 原理
Байду номын сангаас
待测抗原在含在一定量的抗体中自由扩散 在抗原抗体比例合适处形成大分子的抗原抗体复合物而 被限制在网孔中，形成肉眼可见的沉淀环 待测抗原与沉淀环的直径成正比
方法评价
定量检测物质、方法稳定、简便、无需特殊仪器 灵敏度稍差
Ab
双向琼脂扩散试验
• 原理 – 抗原抗体在凝胶中自由扩散，发生相遇 – 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 • 类型 – 成对孔、三角形孔、梅花形孔
(精选医学)沉淀反应
Fahey曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
t1 为 16 ～ 24h ； t2 为 24 ～ 48h ； t3 为 48h 以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
23
标准品抗原浓度测定
不同病人抗原浓度测定
24
62
63
火箭免疫电泳
技术要点
1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血 清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品， 样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉 淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。
64
火箭免疫电泳
影响因素
1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰 化），抵消了电渗作用。
l:支持场的长度 (有效长度)
48
• 影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状
49
外因： 1.电场强度V ( U/L)电场强度越大，带电质点
泳动速度越快。 2.缓冲液的pH (pH恒定)：溶液的pH值决定了带
电质点的解离程度，也决定了物质所带电荷 的多少。 3.离子强度[I]溶液的离子强度越高，颗粒泳动 速度越慢，反之越快。 最适:0.02-0.07 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动. 由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电 感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动
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醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白
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醋酸纤维素薄膜电泳分离血清清蛋白
• 电泳仪器
架膜
加盖
接导线，开机
医学免疫学沉淀反应
医学免疫学沉淀反应在医学免疫学的广袤领域中，沉淀反应是一项具有重要意义的检测技术。
它如同一位默默耕耘的“侦探”，帮助我们揭示体内免疫反应的奥秘，为疾病的诊断和研究提供了有力的支持。
要理解沉淀反应，首先得明白什么是抗原和抗体。
抗原就像是一个个“目标嫌疑人”，它们可能是细菌、病毒的一部分，也可能是体内异常产生的蛋白质等。
而抗体则是免疫系统派出的“抓捕能手”，能够特异性地识别并结合抗原。
沉淀反应的发生，正是基于抗原和抗体的这种特异性结合。
当抗原和抗体在适当的条件下相遇，它们会形成肉眼可见的沉淀物，就好像是“嫌疑人”和“抓捕能手”相互纠缠在一起，形成了一个明显的“团伙”。
常见的沉淀反应有多种类型，其中之一是环状沉淀反应。
想象一下，在一个小玻璃管中，先将抗血清小心地铺在底部，然后再将含有抗原的溶液轻轻地叠加在上面。
由于抗原和抗体的比重不同，它们会形成一个清晰的界面。
如果存在对应的抗原，就会在界面处形成白色的沉淀环，就像是给这个“犯罪现场”圈出了关键的证据。
还有一种是絮状沉淀反应。
把抗原和抗体溶液混合在一起，如果它们相互匹配，就会逐渐形成肉眼可见的絮状沉淀物，如同天空中飘落的雪花，纷纷扬扬地聚集在一起。
免疫比浊法也是沉淀反应中的重要一员。
它利用抗原和抗体结合后形成的免疫复合物，引起溶液浊度的变化。
通过专门的仪器测量这种浊度的改变，可以定量地测定抗原或抗体的含量。
这就好比是给“嫌疑人”和“抓捕能手”的“纠缠程度”进行精确的测量和计算。
沉淀反应在医学实践中的应用十分广泛。
在临床诊断中，它可以帮助检测各种疾病相关的抗原或抗体。
比如，对于某些传染病，通过检测患者血清中的特异性抗体，就能判断是否感染了相应的病原体。
对于自身免疫性疾病，检测体内自身抗体的存在和水平，有助于明确诊断和评估病情。
在药物研发和质量控制方面，沉淀反应也发挥着重要作用。
新药的研发过程中，需要对药物的免疫原性进行评估，沉淀反应可以提供有关药物与免疫系统相互作用的重要信息。
免疫学和免疫学检验：沉淀反应.
免疫学和免疫学检验：沉淀反应沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。
早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应（precipetaiton）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反。
早在1897年Kraus就发现，细菌培养液与相应抗血清混合时可发生沉淀反应。
1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行。
Oudin（1946）报告了试管免疫扩散技术，Mancini（1965）提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展。
另一方面，免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物（参见第九章）。
经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法；而快速免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法。
现代免疫技术（如各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术。
第一节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验为历史较久，又较有用的方法。
该法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。
这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法。
（一）抗原稀释法抗原稀释法（Dean-Webb法）是将可溶性抗原作一系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合，置室温或37℃反应后，产生的沉淀物随抗原的变化而不同。
表12-1系以牛血清白蛋白为例的实验结果。
表12-1Dean-Webb定量沉淀试验管号抗原抗体总沉淀量反应过剩物抗原沉淀量抗体沉淀量沉淀中Ab/Ag1 0.003 0.68 0.093 Ab 0.003 0.090 30.02 0.005 0.68 0.145 Ab 0.005 0.140 28.03 0.011 0.68 0.249 Ab 0.011 0.238 21.74 0.021 0.68 0.422 Ab 0.021 0.401 19.15 0.032 0.68 0.571 Ab 0.032 0.539 16.86 0.043 0.68 0.734 － 0.043 0.691 16.17 0.064 0.68 0.720 Ab －－－8 0.085 0.68 0.601 Ag －－－9 0.171 0.68 0.464 Ag －－－10 0.341 0.68 0.368 Ag －－－单位：mmol/L 从表12-1可以看出，1～5管为抗体过剩管，7～10管为抗原过剩管，唯第6管沉淀物最多，两者之比为16:1，即最适比。
5章 沉淀反应(免疫学)
3.方法评价
操作简便。 灵敏度较高，比双扩高约10倍。 分辨率低于双扩。
4. 临床应用
常用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴 定等
(二) 火箭免疫电泳
火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合，在电场中
加速定向扩散的单向免疫扩散技术，由于其沉淀形
似火箭，故称为火箭电泳。
1. 基本原理
一、透射免疫比浊法
（transmission turbidimetry）
(一) 基本原理
抗原抗体结合后形成的CIC引起液体介质出 现浊度改变，光线的透过量减少，被吸收 光线量与CIC形成量呈正相关，依所测吸光 度值推算待测抗原的量 。
二、散射免疫比浊法
（nephelometry）
1967年， Ritchie等
方法稳定、简便的方法，不需特别仪器设 备，重复性好，但灵敏度稍差(1.25mg/L)。
（四）临床应用
1．血清学诊断:出现沉淀线，表明存在相应的Ag或Ab.
2.
免疫化学分析:浓度、分子量、纯度、反应性 沉淀线靠近抗原孔，提示抗体含量高；反之则反
出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单 一成分。可用于鉴定抗原或抗体的纯度。
三、速率抑制免疫比浊法
(rate inhibition immunoturbidimetry)
是一种竞争性结合试验，主要用于测定半抗原和 药物等小分子物质。
试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大分子） 与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合 物可形成一定的速率散射峰值。
待测抗原与抗体竞争结合，速率散射峰值降低， 降低程度与标本中的待测半抗原成正比。
第5章 沉淀反应 Precipitation
免疫学检验技术沉淀反应
能力目标
掌握：凝胶内沉淀试验和免疫电泳技术的操作方法
熟悉：双扩和免疫电泳技术的结果判读和临床应用
思政-素质目标
爱岗敬业、责任心、细心、耐心、质控和生物安全意识、免疫学思维
本章要点
1. 沉淀反应的概念及特点。 2. 液相内沉淀试验的原理及种类。 3. 凝胶内沉淀试验的原理及种类。 4. 双向琼脂扩散试验的应用。 5. 凝胶免疫电泳技术的种类及原理。 6. 沉淀反应方法的技术要点、影响因素及临床应用。
教学目标
1.掌握：沉淀反应的概念及特点；免疫电泳技术的种类和原理（重点）。
2.熟悉：凝胶内沉淀试验的种类及原理，免疫电泳的应用（重难点）。
3.了解：液相沉淀试验的原理；各种沉淀试验的技术要点和影响因素；沉淀
反应的临床应用。
能力目标
掌握：凝胶内沉淀试验和免疫电泳技术的操作方法
熟悉：双扩和免疫电泳技术的结果判读和临床应用
目录
沉淀反应概述 液相内沉淀反应 凝胶内沉淀反应 凝胶免疫电泳技术 沉淀反应的临床应用
凝胶免疫电泳技术
电泳分析与沉淀反应的结合产物，即可溶性抗原和 抗体在直流电场的作用下，在凝胶内加速定向泳动，彼此 相遇而特异性结合，在比例合适处形成可见的沉淀物。该 技术提高了沉淀反应的速度和敏感度，广泛用于临床实验 诊断和科学研究。
① 抗原稀释法：抗原最适比例 ② 抗体稀释法：抗体最适比例 ③ 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
沉 淀 示 意 图 各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量相同
Ab
Ag
振摇 混匀、37℃孵育
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
沉淀反应(医学免疫学)
对流免疫电泳实验原理
【实验材料】
1．电泳缓冲液：pH 8.6巴比妥缓冲液。 2．抗体：诊断血清（抗HBsAg抗体）。 3．抗原：阳性血清、待检血清。 4．1％琼脂盐水。 5．电泳仪、电泳槽、载玻片、打孔器、移 液器、移液头。
【实验方法】
1．制板 2．打孔 3．加样 4．电泳 将加好样品的琼脂板置电泳槽上，抗 原侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。搭好桥后， 接通电源，控制电压6～10 V/cm板长，电泳约 30～60 min。
5．关闭电源，取出琼脂板 NS 诊 阳 诊 乙 诊乙 诊
正极
【实验结果】
将玻片对着强光源，先观察生理盐水孔与 诊断血清间无沉淀线，阳性血清孔与诊断血清 之间有白色沉淀线，若待检血清孔与诊断血清 孔之间有沉淀线出现，则表示HBsAg阳性，否 则为阴性。
阳极 甲 诊甲 诊
沉淀线的形态、清晰度及位置反应抗原或抗体的特异 性和浓度等。利用已知抗原或体检测未知抗体或抗原。
一、双向免疫琼脂扩散
实验材料：1％盐水琼脂，诊断血清【抗HBsAg （乙型肝炎病毒表面抗原）的抗体】，阳性血 清（含HBsAg），生理盐水，待检血清甲、乙。 载玻片，打孔器，湿盒，微量加样器，吸头， 温箱。
沉淀反应
沉淀反应
可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液 等与相应抗体结合，当两者比例合适、在一 定温度和电解质存在时，形成肉眼可见的沉 淀物或沉淀线，称为沉淀反应。
双向免疫琼脂扩散和对流免疫电泳。
一、双向免疫琼脂扩散
实验目的：检测待测血清中有无HBsAg 实验原理：可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行 扩散，当两者比例合适时，就出现白色沉淀线（阳性反 应）。
一、双向免疫琼脂扩散
实验方法：
1、融化1％盐水琼脂； 2、制备半固体琼脂凝胶； 3、打孔； 4、加样（每孔加满）； 5、标记，放湿盒，37℃温箱24h后观察结果。
医学免疫学沉淀反应实验报告
医学免疫学沉淀反应实验报告一、实验目的1、掌握沉淀反应的基本原理和操作方法。
2、熟悉琼脂扩散试验和免疫比浊法的应用。
3、观察沉淀反应的结果，理解抗原抗体反应的特异性和定量关系。
二、实验原理沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下结合，形成肉眼可见的沉淀物的反应。
根据反应介质和检测方法的不同，沉淀反应可分为液相沉淀反应和凝胶内沉淀反应。
液相沉淀反应包括絮状沉淀试验和免疫浊度测定。
絮状沉淀试验是将抗原和抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成絮状沉淀物。
免疫浊度测定则是通过测量溶液中抗原抗体复合物形成导致的浊度变化，来定量检测抗原或抗体的含量。
凝胶内沉淀反应常用的是琼脂扩散试验，包括单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。
单向琼脂扩散试验是将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，制成琼脂板，然后在板上打孔，加入抗原，抗原在凝胶中向四周扩散，与抗体形成沉淀环。
沉淀环的直径与抗原浓度成正比，可通过测量沉淀环的直径来计算抗原的含量。
双向琼脂扩散试验是将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的不同孔中，两者在凝胶中扩散，形成沉淀线，用于检测抗原和抗体的特异性以及它们之间的相对分子量。
三、实验材料1、试剂抗原：人血清白蛋白（HSA）、羊抗人血清白蛋白抗体（抗HSA）。
生理盐水。
琼脂糖。
巴比妥缓冲液。
2、器材载玻片。
打孔器。
移液器。
分光光度计。
四、实验步骤（一）絮状沉淀试验1、取两支试管，分别标记为“抗原管”和“对照管”。
2、在“抗原管”中加入 05ml 抗原溶液（HSA），在“对照管”中加入05ml 生理盐水。
3、向两支试管中分别加入05ml 抗体溶液（抗HSA），轻轻摇匀。
4、室温放置 10-20 分钟，观察两支试管中溶液的变化。
（二）单向琼脂扩散试验1、制备琼脂板：称取一定量的琼脂糖，加入巴比妥缓冲液，加热溶解，制成 1%的琼脂糖溶液。
将溶液倒入载玻片上，使其均匀铺开，形成厚度约 2-3mm 的琼脂板，待琼脂凝固后打孔。
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基本概念
• 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应生成沉 淀物 • 特点 – 反应物可溶（溶液） – 生成物为沉淀（抗原抗体均为多价，相互结合，形成空 间网格，体积变大而从溶液中析出） – 抗原抗体的比例对试验现象的影响明显 • 类型
液相沉淀试验
反应场所 检测方法
凝胶扩散试验 凝胶免疫电泳试验
• 免疫浊度测定 – 一定比例的抗原抗体反应可生成肉眼不可见的、一定大 小的复合物 – 光束通过该溶液时，免疫复合物对光会产生作用（吸收、 折射），作用的大小与复合物的多少呈正相关 – 根据测量手段和方法的不同可分为：透射比浊法、终点 散射比浊法和速率散射比浊法
透射比浊法
• 原理 – 在固定且过量的抗体中加入待测的抗原，经过一段时间 反应后生成复合物，复合物的量与待测抗原含量成正比 – 当光束通过该溶液时，被复合物吸收、反射，导致透射 光的减少，减少的程度与复合物的量成正比 – 以已知抗原的浓度为横坐标，对应的吸光度为纵坐标， 建立标准曲线，通过测定待测抗原反应后溶液的吸光度 大小，在曲线上测出待测抗原的浓度 • 方法评价 – 灵敏度较高、重复性较好、操作简便、对仪器要求不高 – 反应时间长、参加反应的抗原抗体比例要保证抗体过剩 且不能极度过剩
Байду номын сангаас
待测抗原的浓度与沉 淀峰的高度成正比
1 2 3 4 5
＿
方法评价
操作简单、重复性好，灵敏度高
对流免疫电泳
原理
电场中 的双扩
_
Ag Ab
+
在电场的作用下，抗原抗体相向运动 在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀线 方法评价 将双扩的自由扩散变为定向运动，使反应快速、灵敏度提高
终点散射比浊法
• 原理 – 为改良的透射比浊法（测定散射光强度） • 方法评价 – 方法灵敏、可自动化 – 反应时间适当、影响因素较多、需特殊仪器
速率散射比浊法
• 原理 – 在过量的抗体中加入待测的抗原，两者反应生成免疫复合 物，在反应达终点之前，复合物数量递增 – 在不同的时间点上，复合物增加的量（速率）是不同的， 而最大速率（峰值）只有一个时间点 – 在反应的过程中，峰值出现的时间点很快出现并能被特殊 的仪器捕捉、测出 – 峰值的大小与待测抗原的含量成正比 • 方法评价 – 测量快速、灵敏、精密度高、稳定性好 – 需特殊仪器
单向琼脂扩散试验
• 原理
待测抗原在含在一定量的抗体中自由扩散 在抗原抗体比例合适处形成大分子的抗原抗体复合物而 被限制在网孔中，形成肉眼可见的沉淀环 待测抗原与沉淀环的直径成正比
方法评价
定量检测物质、方法稳定、简便、无需特殊仪器 灵敏度稍差
Ab
双向琼脂扩散试验
• 原理 – 抗原抗体在凝胶中自由扩散，发生相遇 – 在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 • 类型 – 成对孔、三角形孔、梅花形孔
液相内沉淀试验
• 环状沉淀试验 – 原理 将抗原液叠加在已知的抗体溶液上面，在两液的 交界面抗原抗体发生反应生成白色沉淀环 –方法评价 简便快速、但只能定性且 灵敏度低，少用
抗原 沉淀环 抗体
• 絮状沉淀试验 – 原理 抗原溶液与抗体溶液混合，在电解质存在的条件 下，两者结合出现肉眼可见的絮状沉淀 – 方法评价 方法简单，不需特殊设备，灵敏度低，受抗 原抗体比例影响明显，少用；可用于确定对应抗原抗体 反应的最适比
梅花形孔
1:2 1:4
Ag
1:64
1:8 1:32 1:16
中间孔为Ag、周边孔为倍比稀释Ab
出现沉淀线孔的Ab最高稀释度为待测抗体的效价
免疫电泳技术
• 带电颗粒在电场中的运动 – 抗原抗体在凝胶中为带电颗粒 – 在电场的作用下向相反电极运动为电泳 – 某些凝胶（琼脂）固体骨架上基团为阴离子，感应其附 近的水分子带上正电荷，这种水分子在电场的作用下运 动方向为正极到负极，同时推动颗粒的运动为电渗 – 颗粒的运动为电泳和电渗的合运动 • 类型 – 免疫电泳、火箭免疫电泳、对流免疫电泳
成对孔
Ag
Ab A B C D E F
应用
定性：沉淀线的有无
相对浓度：沉淀线的位置（靠近浓度小的一侧） 相对扩散率：沉淀线的形状（弯向扩散慢的一侧）
三角形孔
Ab Ag1 Ab Ag1 Ab
Ag1
Ag2
Ag2
Ag2
沉淀线吻合：两种 抗原完全相同
沉淀线相交：两种 抗原完全不同
沉淀线相切：两种抗 原之间部分相同
免疫电泳
原理
－
＋
电泳：分离复杂组分（不同的蛋白质的PI、分子量不同， 在电场中的运动速度不同，相同时间在凝胶中的停留位置不同） 双扩：在与电泳平行方向挖槽，加混和抗体，与分离开的组分自 由扩散，在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线 应用：用于复杂抗原的成分分析
火箭免疫电泳
原理
＋
电场中的单扩
Ab
在电场的作用下，抗原 在含一定量抗体的凝胶 中扩散 形成肉眼可见的沉淀峰
凝胶的制备
• 原料 – 固体粉末（琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺） – 电解质液 • 过程 按要求把一定比例（1%）的固体粉末与电解质液混 合，加热助溶，冷却，形成具有三维空间网孔的半固体结构 • 性质 – 实为流动的液相 – 网孔的大小与凝胶的浓度成反比 – 小分子的颗粒在凝胶中自由运动，动力来源于物质的浓 度差，而大分子物质的运动则受到网孔的限制