基因组编辑技术
遗传学中的基因编辑技术
遗传学中的基因编辑技术遗传学是研究基因在生物遗传过程中的传递和表达规律的科学。
基因编辑技术是一种通过人工手段修改生物体基因组的技术，这种技术在遗传学领域中发展迅猛，为研究人员提供了改变基因表达和功能的有力工具。
本文将介绍基因编辑技术的原理和应用，并探讨其在医学和农业领域的潜在影响。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术是通过人工干预修改生物体基因组的DNA序列，常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和类CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系统的Cas9。
这些技术可以精确地切割DNA，然后通过细胞自身修复机制引导细胞对目标基因进行修复或替换。
二、基因编辑技术的应用1. 研究基因功能：基因编辑技术可以通过修改特定基因的DNA序列，进而研究该基因在生物发育、生长和疾病等方面的功能。
通过比较不同基因表达型生物体的特点和表型，可以揭示基因的作用机制和调控网络。
2. 治疗遗传性疾病：基因编辑技术为治疗遗传性疾病提供了新的途径。
通过修复或替换有缺陷的基因，可以纠正导致遗传性疾病的突变。
例如，基因编辑技术可用于治疗囊性纤维化、血友病和遗传性失明等疾病。
3. 产生抗病虫害作物：基因编辑技术可以改良植物基因组，使其具备抗病虫害的能力。
通过精确修改作物的抗病虫害基因，可以减少农药的使用，并提高作物的产量和品质。
4. 新型基因治疗：基因编辑技术为开发新型基因治疗方法提供了可能。
通过修改人体细胞中的基因，可以修复导致疾病的遗传突变。
这种个性化基因治疗有望为癌症、心血管疾病和免疫系统疾病等提供创新的治疗方案。
三、基因编辑技术的潜在影响尽管基因编辑技术在医学和农业领域的应用前景广阔，但其潜在影响也需要引起重视。
首先，基因编辑技术的使用需要谨慎，确保对潜在风险进行评估和管理。
其次，基因编辑技术的广泛应用可能引发伦理和道德问题，如人类基因改造的争议。
常用基因组编辑技术
常用基因组编辑技术基因组编辑技术是一项颠覆性的生物技术，通过对生物体的基因组进行精确编辑，可以改变生物体的遗传特性，有着广泛的应用前景。
随着CRISPR-Cas9技术的发展和普及，基因组编辑技术已经逐渐成为生物科学领域的热门研究领域之一。
本文将首先介绍基因组编辑技术的发展历程，然后具体介绍CRISPR-Cas9技术、TALEN技术和ZFN技术，以及它们在基因组编辑中的原理、优势和应用。
一、基因组编辑技术的发展历程基因组编辑技术的发展可以追溯到20世纪初。
早期的基因组编辑技术主要依靠化学诱变、辐射诱变和转基因技术，例如对CRISPR/Cas9 系统上隶属2012年。
这种技术可以精确地识别特定的DNA序列，并进行切割和编辑。
由于CRISPR/Cas9 技术简便易行、高效准确，因此被广泛应用于生物学研究、医学治疗、农业改良等领域。
二、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是目前应用最为广泛的基因组编辑技术之一。
CRISPR是一种天然存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统，可以识别并消灭入侵的病毒和质粒。
借鉴了CRISPR 系统的原理，科学家们成功地将其应用于基因组编辑。
CRISPR-Cas9 系统由crRNA（CRISPR RNA）、tracrRNA（转活化结构化RNA）和Cas9蛋白三部分组成，通过crRNA的引导，Cas9蛋白可以精确地切割特定的DNA序列，从而实现基因组的编辑。
与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR-Cas9技术具有操作简便、成本低廉、高效准确等优势，因此得到了广泛的应用。
CRISPR-Cas9技术在基因组编辑中的应用包括基因敲除、基因敲入、基因修饰等。
通过基因敲除，可以观察特定基因的功能，从而研究其在生物体内的作用机制；通过基因敲入，可以将外源基因引入特定位点，实现对基因组的精准编辑；通过基因修饰，可以对特定基因进行点突变、片段插入等操作，改变生物体的遗传特性。
CRISPR-Cas9技术的应用不仅在生物学研究领域有着重要意义，而且在医学治疗和农业改良方面也有着广阔的应用前景。
常用基因组编辑技术
常用基因组编辑技术随着科学技术的不断进步，基因组编辑技术逐渐成为了现代生命科学领域的热点之一。
通过基因组编辑技术，人类有望对基因进行精确的编辑和控制，从而实现对遗传疾病的治疗、农作物的改良、生物能源的开发等多个领域的重大突破。
在这篇文章中，我们将介绍一些常用的基因组编辑技术，包括CRISPR/Cas9系统、TALENs以及ZFNs等，这些技术的原理、应用和发展前景。
一、CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是目前应用最为广泛的一种基因组编辑技术。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古细菌中的一种自然免疫系统，其功能是识别并清除侵入的病毒和外源DNA。
而Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有能够精确切割DNA链的功能。
CRISPR/Cas9系统的原理是通过将设计好的RNA序列（guide RNA，gRNA）与Cas9蛋白结合，使其特异性地与目标DNA序列结合，从而实现对DNA的切割和编辑。
这一技术具有操作简单、成本较低、高效率、高精准度等优点，因此被广泛应用于基因敲除、基因点突变、基因插入等领域。
CRISPR/Cas9系统还能够实现对多个基因的同时编辑，从而为复杂基因组编辑提供了可能。
在应用方面，CRISPR/Cas9系统已经在治疗遗传性疾病、改良农作物品种、实现动物模型的快速建立等方面取得了显著的成果。
基于CRISPR/Cas9系统的技术开发也在不断深入，例如通过将Cas9蛋白的切割功能与调控功能相分离，实现对靶基因的激活或抑制等，为人类基因组编辑的更多可能性。
尽管CRISPR/Cas9系统有其局限性，例如存在离靶效应、特异性限制等，但其应用前景依然广泛，尤其是在生物医学、再生医学、农业等领域。
二、TALENsTALENs（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）是一种由一种存在于特定植物病原细菌中的一种转录激活因子（Transcription Activator-Like Effector, TALE）结合核酸酶形成的基因组编辑技术。
基因组编辑技术的原理及其应用
基因组编辑技术的原理及其应用随着科学技术的不断进步，人们对于基因组编辑技术的应用越来越广泛。
基因组编辑技术是对生物体的基因组进行修改和精准操控的一项技术，可以说是人类医学科学历史上的一次重大突破。
该技术涉及到许多领域，包括植物育种、动物育种、基因治疗等多个方面。
本文将对基因组编辑技术的原理及其应用进行详细介绍。
一、基因组编辑技术的原理基因组编辑技术是指利用特定的蛋白质和DNA序列，对人体基因组进行“剪切”和“粘贴”的操作，改变人体的遗传性状，达到治疗或预防疾病的目的。
目前基因组编辑技术的主要方式是采用CRISPR/Cas9技术，其基本原理是利用一种双链RNA技术，在靶标DNA上产生双链断裂，并将外源或内源DNA序列插入到目的位置上。
CRISPR是细菌天然免疫系统的一部分，用于识别和破坏入侵的病毒基因组。
Cas9是一个RNA指导的核酸内切酶，可以被程序性RNA精确定位在目标DNA上，然后切割该DNA，并将所需的外源DNA序列插入到目标位点上。
因此，利用CRISPR/Cas9技术，可以在人体基因组中切除或插入特定的DNA序列，从而改变人体的遗传性状。
二、基因组编辑技术的应用1. 植物育种基因组编辑技术在植物育种方面的应用，可以加速植物基因组的研究和改良，从而提高作物的产量和品质。
例如，在水稻中应用基因组编辑技术，可以使获得更耐旱、耐盐、抗病的品种，并且可以提高其食品价值和营养价值。
2. 动物育种基因组编辑技术在动物育种方面的应用，可以提高动物的产量和品质，例如在奶牛中应用该技术，可以提高牛奶的蛋白质含量，并且可以减少对抗生素的依赖。
同时，也可以利用基因组编辑技术创造新的动物品种，如利用CCS技术制造“迷你猪”等。
3. 基因治疗基因组编辑技术在基因治疗方面也有着重要的应用，可以治疗一些遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病、糖尿病等等。
目前已经有基因组编辑技术治疗成功的疾病，例如在中国利用基因组编辑技术治疗了一个罕见遗传性血液疾病——β珠蛋白病。
基因组编辑方法
基因组编辑方法
基因组编辑，又称基因编辑（gene editing），是指一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术。
基因组编辑技术主要包括以下几种方法：
- 第三代基因编辑技术：CRISPR-Cas9，这种技术能以极其简单的方式对基因进行精准操作——编辑。
- TALEN 技术：这是一种依靠 TALEN 蛋白对基因组进行编辑的方法。
TALEN 蛋白由一对核酸酶和一对与目的 DNA 序列互补的核酸组成，可以在特定的位置切断 DNA 双链，并进行基因编辑。
- ZFN 技术：ZFN 是一种由一对锌指核酸酶和一段与目的 DNA 序列互补的寡核苷酸组成的基因编辑工具。
ZFN 可以特异性地识别并结合到目的 DNA 序列上，然后在锌指核酸酶的催化下切断 DNA 双链，实现基因编辑。
利用基因组编辑技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的DNA片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。
基因编辑技术概述
基因编辑技术概述基因编辑技术，也称基因工程技术、基因修饰技术，是一种能够直接对生物体基因组进行精准操作的技术。
它通过改变细胞或有性系生物体中的特定DNA序列，实现对基因组的修改和重塑。
基因编辑技术的发展对医学研究、农业改良和生物学研究等领域都产生了重大影响。
本文旨在介绍基因编辑技术的原理、应用领域以及引发的一些伦理和法律问题。
一、基因编辑技术的原理基因编辑技术主要采用一种名为CRISPR-Cas9的系统，CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”的缩写，意为“短回文重复序列的成簇排列”。
Cas9是一种酶，具有切割DNA的能力。
该系统通过引导RNA与特定的DNA序列结合，将Cas9蛋白导向特定基因位点，并将DNA切割或修复产生所需的基因改变。
二、基因编辑技术的应用领域1. 医学研究领域基因编辑技术在医学研究中有着广泛的应用。
通过编辑细胞中的特定基因，科学家可以模拟和研究各种疾病，如癌症、遗传性疾病等。
基因编辑技术还有望应用于基因治疗，即通过修复或替换患者体内的异常基因，达到治疗疾病的效果。
2. 农业改良领域基因编辑技术可以用于改良农作物和家畜，提高其产量、抗病能力和抗逆性等特性。
例如，科学家通过编辑玉米基因，使其能够在干旱条件下生长，以应对气候变化的影响。
此外，基因编辑技术还可以用于改善食品的品质，增加营养价值。
3. 生物学研究领域基因编辑技术为生物学研究提供了强有力的工具。
通过编辑实验动物的基因，科学家可以揭示特定基因对生物体发育、生长和行为等方面的影响。
此外，基因编辑技术还可以用于研究基因与环境之间的相互作用，拓展人类对生命的认识。
三、伦理和法律问题虽然基因编辑技术具有许多潜在的应用前景，但也引发了一系列伦理和法律问题。
首先，基因编辑技术可能导致人类基因组的不可逆性、持续性修改，因此如何确定修改的范围和目的成为一个重要的问题。
三代基因组编辑技术
首先，锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的设计和合成过程较为复杂，需要较 高的技术水平和经验；其次，由于这两种技术需要将蛋白质引导至细胞核内，因此对细 胞具有毒性作用；此外，由于这两种技术需要识别和切割DNA序列，因此可能存在脱
靶效应和基因突变的风险。
03
第二代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）
总结词
胞嘧啶脱氨酶引导的编辑是一种利用胞嘧啶脱氨酶对DNA进行精准编辑的方法。
详细描述
胞嘧啶脱氨酶能够将DNA中的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），进而在随后的DNA复制过程中导致基因 突变。通过将特定的脱氨酶与CRISPR-Cas9系统结合，可以实现精准的基因组编辑。
基因组编辑的最新进展与前景
总结词
04
第三代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）的改进与优化
高效性
通过优化碱基编辑器的脱靶效应 和编辑效率，提高其在基因组中 的精准度和可靠性。
特异性
改进碱基编辑器的识别机制，降 低其在基因组中脱靶编辑的可能 性，提高编辑的特异性。
适用性
拓展碱基编辑器的应用范围，使 其适用于更多种类的基因突变和 遗传疾病的治疗。
随着技术的不断进步，基因组编辑技术 正在不断发展，未来有望在医学、农业 等领域发挥更大的作用。
VS
详细描述
近年来，基因组编辑技术取得了许多突破 性进展，例如开发出更加高效和精准的编 辑工具，以及在人类疾病治疗和农作物改 良等领域的应用。未来，基因组编辑技术 有望在更多领域发挥重要作用，为人类带 来更多的福祉。
三代基因组编辑技术
目录
• 基因组编辑技术概述 • 第一代基因组编辑技术 • 第二代基因组编辑技术 • 第三代基因组编辑技术
生物学中的基因组编辑技术
生物学中的基因组编辑技术
基因组编辑技术的出现为生物学的发展带来了一个新的时代。
基因组编辑技术是指在细胞或生物体中对基因组的DNA序列进行
精确修饰的能力。
它包括了利用不同的方法对基因组进行删除、
插入、修改等操作。
而其中最重要的技术就是CRISPR-Cas9技术。
CRISPR-Cas9技术的出现让基因组编辑技术达到了一个新的高度。
CRISPR-Cas9技术是指通过编程Cas9蛋白去切割DNA，然
后被设计的sgRNA来指导它切割的位置和同时实现编辑。
这个技
术可以精确地切割DNA并修改目标基因，而且操作简便成本低，
因此被广泛应用于许多领域，包括基因治疗、生物医学、作物增
产等。
基因治疗是CRISPR-Cas9技术最重要的应用之一。
一些基因疾病、肿瘤和遗传病可以通过CRISPR-Cas9技术得到改善或治愈。
例如，目前病毒感染等重疾的治疗很多时候是较难的，而
CRISPR-Cas9在这方面可以为治疗提供新的方法。
基因编辑技术
还被广泛用于生物医学研究，如对病毒、细胞生长和代谢方面的
研究。
此外它还能用于作物的改良和增产，使得生产效益得到提高。
但基因编辑技术在实际应用过程中也存在一些问题。
例如，在进行基因编辑时不可避免地会对非目标基因产生不良效应，包括细胞突变、不必要的DNA剪切等。
此外，在基因编辑的过程中需要严格控制一系列因素，如孵育时间、温度等，以保证实验的可靠性。
总之，基因编辑技术的出现为生物学的研究提供了一种全新的手段，但这种技术也需要我们注意其合理的安全使用，同时也需要我们进一步的研究和技术改进。
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研究现状
（Miao, J. et al ., 2013）
（Miao, J. et al ., 2013）
（Feng, Z. et al ., 2013)
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16/4/18
研究现状
• 2013年4月12日发表在《cell stem cell》上的一篇文章， 作者利用TALENs 和CRISPRs对人类细胞的同一基因进行修 饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。
• 不久, Carroll 与Chandra合作, 在爪蟾( Xenopus laevis ) 卵母细胞开展了ZFN 介导的外源DNA修复实验, 并取得了成功(Bibikova等2001)。
• 2002年, Carroll 又用ZFN 敲除了果蝇( Drosophila melanogaster)的一个内源基因(Bibikova等2002)。
基因组编辑技术
Gene editing tools
• ZFN • TALEN • Case9 RNA-guided
endonuclease
16/4/18
• Nature杂志介绍了2014年值得关注的技术,包括 CRISPR和基因组编辑
• 2011 Nature年度技术：人工核酸酶介导的基因组 编辑（genome editing with engineered nucleases）技术
(Sanjana et al., 2012)
How does it work?
切割原理
活性
(Sanjana et al., 2012)
以二聚体发挥切割
修复原理
ü 当体内无模板时，诱发DNA损伤 修复机制。细胞可以通过 NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA， 在此修过 程中删除或插入了一定数目的 碱基，造成移码，形成目标基 因敲除突变体。
• 2013年9月3日在《Cell Research》上由北京大学生命科学 学院的瞿礼嘉教授研究团队利用最新的CRISPR-Cas系统 成功地实现了对水稻特定基因的定点突变，效率达到80% 以上。
CRISPRs VS TALENs
ü 在实际应用上，CRISPRs比TALENs更容易操作。因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPRs 的gRNA只需要替换20个核苷酸就行，Cas蛋白不具 特异性。
(Jinek, M. et al ., 2012)
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The type II RNA-mediated CRISPR/Cas immune pathway
• gRNA
CRISPR RNA (crRNA) trans-activating crRNA (tracrRNA)
HNH亚基，切割互补链
• 2013 年 8 月8日在《Nature Biotechnology》上发表的一 文中，作者利用CRISPR- Cas系统定点突变了水稻和小麦 的OsPDS和TaMLO等5个基因。结果表明，水稻转基因植 物中突变效率为4-9.4%，这项研究首次证实了CRISPRCas系统能用于植物的基因组编辑。
• 在临床治疗上，人们不能预期引入的ZFN蛋白是不是会引起免疫系统 的进攻。
• 锌指核酸酶技术从一开始就被Sangamo生物公司所垄断，该公司只与 部分科研机构合作，它与大规模的临床应用甚至是实验室研究尚有很 大距离。
转录激活子样效应因子
(Transcription Activator-like Effectors)
• 测序
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TALENs VS ZFNs
• 锌指模块识别三联体碱基，而TALE结构域识别单个 碱基。
• 三个锌指模块串联意味着在识别序列如何识别上存 在更少的灵活性，尽管有上百个锌指模块存在，仍 然不能代表每个可能的序列。
• 锌指模块需要大量优化才实现特异性基因打靶，然 而TALE似乎即设计即使用就可以非常好地发挥作用。
基因组编辑技术：又称为基因组定点修饰技术，原则
上能在任何物种基因组的任何位置上进行定点切除，从而能 在内源性序列上产生突变。
锌指核酸酶 （ZFN）
归巢核酸内切酶（engineered meganucleases）
人工核酸酶 转录激活因子样效应物核酸酶
（transcription activator-like effector ucleases，TALENs）
• 转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)：TALEs首 先是在植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现 的，特异性地结合DNA，在该病原菌感染过程中对 植物基因进行调控。一个TALE上用于序列特异性 识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生 双链断裂(double strand break, DSB)的内切核 酸酶(FokI)的催化性结构域，便产生了TALEN。
• 这两个实验标志着用ZFN 定点修饰真核生物基因组的开端
ZFN工作原理
(Miller, J.C. et al ., 2007) R.et al., 2011)
(Gabriel，
ZFN技术的临床运用
• 传统的基因治疗的方式主要有两种，一种是利用病毒携 带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的 DNA序列来修正错误然，而到安全性无法保证。
ü 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs 更简单方便。
• sgRNA是在crRNA：tracrRNA 基础上改造来的，二者功能 相同
(Jinek, M. et al ., 2012)
CRISPR-cas的作用位点
（Jinek, M. et al .,2012)
orange：crRNA和tracrRNA 形成发卡结构区域 yellow： protospacer DNA gray：The PAM sequence blue arrows：互补链的断裂位点 red arrow：非互补链的断裂位点
• 发展基因治疗上最基本的原则是同源重组。包括两个步 骤：首先在DNA中引入一个双链断裂，启动细胞自身的修 复系统；之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模 板修复这段基因，从而实现指定部位的碱基替换。
• 2005年，Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而引起严重 的免疫不全症，针对此疾病设计了四指的ZFN，利用该系 统介导了人类细胞IL2R的高效修复。在无选择压力下修 复效率达15%~18%，这样的修复效率已足够用于基因治疗。
• 该酶的催化活性必须要在DNA序列上 形成相互靠近的二聚体后才能发挥 内切酶的作用，因此，构建的人工 核糖核酸酶大多是由一对分别识别 把位点两侧DNA序列的蛋白组成。
5'-GGATG-3' 3'-CCTAC-5'
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ZFN的发现
• 最早的ZFN 出现在17年前。Johns Hopkins大学的Chandra 把锌指(zinc finger, ZF) 结构域与IIs型限制性核酸内切 酶FokI的切割域融合, 获得了具有新识别特性的核酸内切 酶(Kim等1996)。
• 单链RNA介导的CRISPR-Cas9
FokI
• 是一种存在于细菌Flavobacterium Okeanokoites 的typeIIs 限制酶， 分子量为65.4KDA，含584个氨基酸， 包含有位于N端的DNA结合区域，以 及一个位于C端的非专一性DNA切割 区块。当此酶与DNA识别域结合后， 会把位于结合位置下游的9-13个核 苷酸切除（不需特定序列）。
单链RNA介导的CRISPR-Cas9
• 锌指核酸酶（ZFN）：zinc finger nuclease，又 名锌指蛋白核酸酶，是一种人工改造的核酸内切 酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切 酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定 位点结合，而非特异性核酸内切酶赋予剪切功能， 两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。
TALE
Xanthomonas(黄单胞菌） 三型分泌系统
(Type Ⅲ secretion system, T3SS)
TALEN的发展
• 1989年，人们发现了TALE蛋白家族的第一个成员 AvrBs3。
• 2009年，揭示了TALE蛋白特异结合宿主基因启动 子的机制。
TALE的结构
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CRISPR-Cas system
三者共进化，形成一个完整的保守系统，且共同 决定CRISPR的亚型，间隔序列提供系统的特异性
Leader：作为启动子 Cas gene：较大的多态性家族, 编码的蛋白携带有典 型的核酸酶、解旋酶、聚合酶以及多核苷酸结合蛋白的 结构域相关的功能域。
The type II RNA-mediated CRISPR/Cas immune pathway
ü 当通过TALEN产生DSB后，若能 提供同源修复模板，细胞可通 过同源重组方式修复DNA，因此 可以对内源DNA做更精细的操 作， 如点突变（磷酸化位点）、 保守区域替换等。
突变检测
• 酶切
利用实验设计时挑选的， 位于相邻靶位点之间的特异性 内切酶位点，可进行PCR产物 酶切鉴定，以筛选发生目标基 因敲除的突变个体。
TALEN的发展
• 2011年，首次把TALE与FokI结合在一起组成TALEN， 并证实TALEN起到分子剪刀的作用。
• 2012年，清华大学施一公带领的团队通过解析 TALE蛋白的晶体结构，清晰地揭示了TALE蛋白特 异识别DNA的机理。
……
Natural structure of TALEs derived from Xanthomonas sp
ZFN技术的不足
• 寡核苷酸链的长度大约为15-16个核苷酸时可以保证识别的特异性。 一个锌指结构域只能识别3bp，而如果用锌指基序作用识别的基本单 位的话，大约需要5-6个锌指串联，操作繁琐。