免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置
免疫组化对照设计
原则上讲，所有实验都应该设置阳性对照（用以检验染色过程成功），阴性对照（用以检验阳性结果为真阳性），空白对照（用以排除非特异背景染色）。
不过，由于样本选取的复杂性，国内多数实验室以及国外多数小实验室，都无法做到规范的阴性对照，所以普遍以空白对照代替阴性对照，而这种方法也在国内外得到承认。
1）空白对照：第一抗体由PBS取代。
2）严格的阴性对照：用已知的确定不表达你所要检测的抗原的其他组织的切片做阴性对照3）回收实验阴性对照：已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。
4）同型抗体替代对照：用于第一抗体同种动物的血清或非免疫IGg代替第一抗体结果为阴性。
5）自身对照在同一切片上，应将不同组织成分中的阴性结果与检测的目的物对照比较不过目前绝大多数人都是用PBS来代替一抗作为阴性对照，其实质是空白对照，因为这样做如果结果是阴性，也只是排除了二抗引起的非特异而已，但至于一抗是否会产生非特异，那只通过空白对照是不得而知的。
因此你就必须做严格意义上的阴性对照。
免疫组织化学染色结果的判定
（三）免疫组织化学染色结果的判定1、对照的设立设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。
主要是针对第一抗体对照，常用的对照有阳性对照、阴性对照。
（1）阳性对照是用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果。
证明整个染色程序符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照就更加重要。
（2）阴性对照是用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，另外空白、替代、吸收和抑制试验均为阴性对照。
当阴性对照成立时，才能判定检测结果，主要用于排除假阳性。
对免疫组织化学染色结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复试验，最好用几种其它方法进行验证，如用 SP 法阳性，可再用ABC法、PCR等验证。
必须学会判断特异性染色和非特异性染色，这对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。
特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如细胞质、细胞核和细胞表面，即具有结构性。
特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果，非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色，非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。
在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色，有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
2、阳性细胞的染色特征免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。
（1）阳性细胞染色分布有三种类型：①细胞质；②细胞核；③细胞膜表面。
大部分抗原见于细胞质，可见于整个胞质或部分胞质。
（2）阳性细胞分布可分为散在、灶性和弥漫性。
宫颈免疫组化结果判读标准
宫颈免疫组化结果判读标准
宫颈免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）检测主要用于宫颈病变、肿瘤等相关疾病
的诊断、鉴别诊断以及分子靶标研究。
宫颈免疫组化结果的判读标准主要包括以下几个方面：
1. 阳性对照：使用已知含有目标抗原的组织作为阳性对照，如正常宫颈组织、阳性病例组织等。
阳性对照应显示明显的染色信号，以证实抗体与目标抗原的特异性结合。
2. 阴性对照：空白对照（不加一抗，使用PBS或一抗来源的动物血清）和阴性组织对照（使用本身不表达该抗原的组织，如肌肉、结缔组织等）。
阴性对照应显示无染色信号，以排除非特异性染色等干扰因素。
3. 染色质量：评估染色过程中的操作规范性，如染色步骤遗漏、显色剂选择、缓冲液pH和离子强度等。
优质染色应呈现清晰、鲜明的颜色分布，无明显背景染色。
4. 抗原表达程度：根据染色强度和阳性细胞比例进行评分。
通常采用半定量评分法，如0分为无染色，1分为弱染色，2分为中等染色，3分为强染色。
评分越高，说明抗原
表达越明显。
5. 阳性细胞分布：观察阳性细胞在宫颈组织的分布情况，如弥漫性分布、局灶性分布等。
阳性细胞分布越广泛，说明抗原表达越活跃。
6. 结合临床资料：将免疫组化结果与临床病史、影像学检查等其他检测结果相结合，综合判断患者的病情和预后。
需要注意的是，宫颈免疫组化结果的判读应充分考虑个体差异、实验操作规范性、抗体质量和实验设备等因素。
在实际工作中，应遵循以上判读标准，确保结果的准确性和可靠性。
同时，不断优化实验方法和设备，提高宫颈免疫组化检测的灵敏度、特异性和稳定性，以更好地为临床诊断和治疗提供科学依据。
免疫组化判读标准
免疫组化判读标准
免疫组化判读标准主要包括以下几个方面：
1. 染色结果的合格性：合格的染色结果应该是背景颜色浅淡或无着色，而阳性标志物清晰和定位明确。
2. 阳性信号的分布和形态特征：在判断染色结果时，不仅要看所检组织中是否存在阳性标记物，还要注意阳性信号的分布部位和形态特征。
一般来说，阳性信号应与被测抗原所在的部位一致，包括组织和细胞的不同区域。
3. 阴性结果的解读：阴性染色结果表示组织内预期特定区域中未见抗原表达，但这并不意味着抗原不表达。
阴性结果可能受到多种因素影响，如标本处理、方法学因素等。
因此，阴性结果不能立即视为否定意义。
4. 阳性标记的色度特征：阳性结果的显色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。
根据阳性标记的显色程度，可分为淡黄色（弱阳性）和棕黑色（强阳性）。
在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。
5. 对照实验的设置：免疫组化染色实验必须设置阳性对照和阴性对照，以确保抗原表达的特异性和IHC技术操作的正确性。
如果对照组的结果出现问题，如阴性对照呈阳性反应或阳性对照呈阴性反应，则说明实验结果失去意义，需要重新进行实验或换用其他抗体。
6. 抗原表达的特定部位：抗原表达必须在特定部位进行判断。
如果抗原在非预期部位表达，则可能存在假阳性或假阴性结果。
综合以上标准，免疫组化染色结果的判读需要综合考虑多个因素，包括染色结果的合格性、阳性信号的分布和形态特征、阴性结果的解读、阳性标记的色度特征、对照实验的设置以及抗原表达的特定部位等。
通过综合分析这些因素，可以对免疫组化染色结果进行准确的判断。
免疫组化染色阳性对照的设立、制作与应用
Ｃ Ｄ ３ ４ 粘 膜下层血 管 内皮 阳性 ； Ｄ ２ — ４ ０ 、 Ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ Ⅷ为淋 巴 管 内皮 阳 性 ； Ｌ Ｃ Ａ、 Ｃ Ｄ ２ ０ 、 Ｃ Ｄ ７ ９ ａ 、 Ｃ Ｄ Ｉ Ｏ淋 巴 细 胞 阳 性， Ｃ Ｄ ２ １ 、 Ｃ Ｄ ２ ３在 固有 层 的淋 巴小 结 滤 泡 生 发 中 心
外 膜等 结 构 。将 阑尾 、 乳 腺 和 扁 桃 体 组 织 分 成 Ａ、
和扁桃体 等不同类型的组织 ， 通 过 ＨＥ切 片 观 察 ， 选取合适 相应抗原表达 的区域 ， 将 组织切成 ０ ． ３ ｃ ｍ ＊０ ． ３ ｃ ｍ 大小 ， 重 新 作 石
蜡包埋 ， 连续切片厚 ４ ｍ， 贴在待检查组织旁边作 为对照 ， 进行 Ｃ Ｋ、 Ｃ Ｋ１ ９ 、 Ｓ ＭＡ、 Ｃ Ｄ ２ ０ 、 Ｃ组 化
口］
。
经来 源 的抗 体有 Ｖｉ ｍｅ ｎ ｔ ｉ ｎ 、 Ｓ — １ ０ ０ 、 ＮＳ Ｅ、 Ｃ Ｄ５ ６ ， 标记 血 管 及 淋 巴 管 内皮 的 抗 体 有 Ｃ Ｄ３ １ 、 Ｃ Ｄ３ ４ 、 Ｄ ２ — ４ Ｏ 、 Ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ Ⅷ， 淋 巴瘤相关抗 体有 Ｌ Ｃ Ａ、 Ｃ Ｄ２ ０ 、 Ｃ Ｄ ７ ９ ａ 、
２ ．方法
选 取 的组 织 通过 ＨＥ染 色 观 察 ， 根 据合 适 相 应
抗 原 表达 的 区域 ， 将 各 组 织 切成 ０ ． ３ ｃ ｍ ×０ ． ３ ｃ ｍ 大 小 进行 再 包埋 ， 保 证 各 组 织包 埋 面含 有 相 应 的组 织 成分 ， 如 阑尾组 织 应 含 有 粘 膜层 ， 粘膜下层 ， 肌 层 和
刘 妮 李 淑 华 梁 英 杰 杨 诗 聪
（ 中 山大 学 附 属 第一 人 民 医院 病 理 科 广州 ５ １ ０ ０ ８ ０ ） ［ 摘要］ 目的 探 讨 如 何 设 立 免 疫 组 化 染 色 的 阳 性 对 照 ， 使 操作更 简单 、 结 果 可 靠 和 方 法 实 用 。方 法 选 取 阑 尾 、 乳 腺
免疫组化对照
免疫组化对照展开全文来源：阿里巴巴生意经在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。
由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，因此对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。
常用的对照组有以下几种：一、阳性对照：用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。
每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。
特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。
所以若预期染色结果是阴性时，就必须设阳性对照。
二、阴性对照：用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。
阴性对照可证实组织内若不含靶抗原，就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。
三、空白对照：是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS 替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色。
四、替代对照：用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。
这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。
但使用的商品抗体往往不能用同一种动物的免疫前血清做替代对照，也可用未经免疫的同种动物血清，即非免疫血清替代一抗。
五、吸收试验对照：用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。
六、自身对照：用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。
免疫组化常用的对照方法
免疫组化常用的对照方法
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质表达的技术。
在进行免疫组化实验时，对照组是非常重要的，它可以帮助确定实验结果的准确性和可靠性。
以下是免疫组化常用的对照方法：
1. 阴性对照，阴性对照是使用不含目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以帮助排除假阳性结果，即实验结果中出现的信号并非由于目标蛋白的存在所致。
2. 正性对照，正性对照是使用已知含有目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。
这可以确保实验条件下目标蛋白的免疫反应性，并验证实验方法的可靠性。
3. 内部对照，内部对照是在同一组织样本或细胞中使用与目标蛋白不同但稳定表达的蛋白作为对照。
这有助于纠正实验中可能存在的变异性，如组织处理、染色效果等。
4. 同型对照，同型对照是使用与目标蛋白相同种属来源的免疫球蛋白（IgG）作为对照。
这可以帮助排除实验中可能存在的非特异
性结合或交叉反应。
以上是免疫组化常用的对照方法，正确选择和使用对照可以有效地确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，为科研工作提供有力的支持。
免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置
免疫组化中的阳性对付照与阳性对付照怎么样树坐之阳早格格创做问题：免疫组化中的阳性对付照与阳性对付照怎么样树坐？参照睹解1：阳性对付照：已知含有要测的抗本的构制.阳性对付照：不妨搞几种：空黑对付照：免去一抗代替对付照：免疫前血浑代替一抗已知阳性构制压制考查：已标记表记标帜抗体要收文章提议搞代替对付照.参照睹解2：楼上回问的真好，不过构制内对付照的合理使用不妨免去树坐真验对付照的很多贫苦！问题：免疫组化技能(IHC)的便宜是什么参照睹解：1．特同性强免疫教的基根源基本理决断了抗本与抗体之间的分离具备下度特同性，果此，免疫组化从表面上道也是构制细胞中抗本的特定隐现，如角蛋黑（keratin）隐现上皮身分，LCA隐现淋巴细胞身分.惟有当构制细胞中存留接叉抗本时才会出现接叉反应.2．敏感性下正在应用免疫组化的起初阶段，由于技能上的节制，惟有间接法、间接法等敏感性不下的技能，那时的抗体只可密释几倍、几十倍；当前由于ABC法大概SP法的出现，使抗体密释上千倍、上万倍以至上亿倍仍可正在构制细胞中与抗本分离，那样下敏感性的抗体抗本反应，使免疫组化要领越去越便当天应用于惯例病理诊疗处事.3．定位准确、形态与功能相分离该技能通过抗本抗体反应及呈色反应，可正在构制战细胞中举止抗本的准决定位，果而可共时对付分歧抗本正在共一构制大概细胞中举止定位瞅察，那样便不妨举止形态与功能相分离的钻研，对付病理教钻研的深进是格中蓄意思的.免疫组化罕睹问题的处理参照意睹：当免疫组化染色不出现预期截止时，应系统天查找本果，而每一次只可排除一种大概的本果.对付照/标本无染色①确认是可忽略了该当加的某种试剂，包罗一抗、二抗、三抗及底物等.②确认所有的试剂是可按精确的程序加进，是可孵育了脚够的时间.③对付照抗体的标签确认是可使用了精确的抗体，以及所用的检测系统是可战一抗匹配，那一面利害常要害的.比圆，如果一抗是兔根源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗去匹配；大概一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗.④查看抗体所使用的密释度及密释溶液.⑤查看抗体的灵验期战保存条件，更加是标记表记标帜了酶大概荧光素的抗体，当前大普遍试剂公司的抗体均央供正在4~8℃条件下保存，应预防反复冻融，试剂保存时一定要预防与挥收性有机溶剂共搁一室，免得落矮抗体的效价.⑥查看标本的储藏条件，最佳用已知阳性的标本本共时搞阳性对付照.⑦查看色本/底物溶液，最简朴的检测要领是将一滴标记表记标帜有酶的抗体加进到制备好的底物溶液中，如果底物爆收预期的颜色变更，则可排除底物的果素.需要注意的是，有些底物正在制成处事液后应正在一定时间内用完，可则会做废.⑧查看浑洗液是可战反招考剂匹配，溶液的pH值很要害，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不该含有叠氮钠.⑨查看复染剂战启片剂是可战所使用的色本匹配.强阳性如果阳性对付照不染色而阳性对付照标本强阳性，除了思量上述果素中，还招思量：①标本的牢固办法，不当的牢固办法大概牢固时温度过下，皆市效率到所检测的抗本的数量战品量.②不适合的抗本建复办法，由于石蜡切片正在创制的历程中牢固剂对付抗本的启关效率，必须用抗本热建复大概酶消化大概二种共时使用的抗本单表露法，至于使用哪一种要领，应参照死产厂家的证明，共时分离标本的简曲情况而定.③抗体的密释度是可过下大概者孵育的温度/时间是可精确.普遍试剂死产厂家皆市对付试剂给出一定的使用范畴，然而是由于使用者的标本本自百般构制，处理历程也不尽相共，所以应参照使用范畴，对付所使用的一抗举止梯度尝试，找出最佳的使用浓度.④切片上遗留了过多的浑洗液，当抗体加至切片上时，等于人为天对付抗体举止了进一步的密释.⑤孵育时切片是可搁置火仄，可则会引导抗体流逝.如果阳性对付照不反应，阳性对付照反应劣良，而标本强阳性，则大概是由于阳性对付照不是共一种构制、大概牢固办法分歧等本果所致.非特同性染色①是可灵验天去除了内源性酶战死物素.应注意的是，本去不是每一种构制均需要举止此步调，然而对付于内源性酶大概死物素歉富的构制，如肝净、肾净等，需思量此本果.处理的要领为：灭活碱性磷酸酶：最时常使用的要领是将左旋咪唑（24mg/m1）加进底物液中，并脆持pH值正在7.6~8.2，即能与消大部分内源性碱性磷酸酶，对付于仍能搞扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸压制.鼓战处理内源性死物素：与消内源性死物素的要领是预先滴加亲战素，以鼓战内源性死物素，使之不再有结余的分离位面.简曲要领是正在ABC法大概SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲战素溶液中处理15分钟，PBS荡涤15分钟后即可染色.②是可采用使用了精确的启关血浑.电荷吸附所制成的非特同性背景染色与消要领是以二抗动物的非免疫血浑，用PBS密释为3%-10%溶液孵育切片，以启关吸附位面.偶尔其余无关蛋黑，如牛血浑黑蛋黑也常应用.其余，与材时躲启出血、坏死区亦极要害.迩去有些海内的真验室应用5%脱脂奶粉代替血浑举止抗本启关，效验也不错.③所采用的抗体是可切合考查央供.果抗本不杂、标本片中含有与靶抗本相似的抗本决断簇等本果制成的非特同性染色只可通过采与下杂度、下效价的抗体、大概针对付更具特同性抗本决断簇的单克隆抗体去办理.④一抗的使用浓度是可过下.⑤荡涤是可充分.应庄重支配规程.果正在慢冲液中含有一定量的盐，那亦有好处减矮背景着色，常常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于普遍染色要领，溶液内加进吐温20，效验更好.特殊标记表记标帜时，试剂公司普遍皆提供慢冲液的配圆.⑥ DBA的使用是可精确.DAB的孵育时间战配制办法不妨爆收某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请庄重依照证明书籍标明的滴加程序支配，注意矫正蒸馏火的pH值，以保证据验截止的精确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，那些颗粒须通过滤与消，可则大概重积于切片构制上，爆收乌面状着色.其余，DAB保存不当爆收氧化物亦可重积于切片上，果此需将DAB保存于躲光搞燥处，现用现配，临用前加H2O2.孵育时间过少也会制成背景染色.⑦标本染色历程中是可曾搞涸，可则会制成边沿部的非特同性染色.⑧查看二抗与标本的内源性构制蛋黑是可有接叉反应.1、染色过强本果－－－办理办法A、抗体的浓度过下大概抗体孵育时间过少－－－落矮抗体滴度（普遍指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时大概4℃过夜B、孵育温度过下，孵育温度超出37℃－－－普遍室温20-28℃C、DAB隐色时间过少大概DAB浓度过下－－－隐色时间不克不迭超出5-10分钟，以隐微镜下瞅察为准2、非特同性背景染色本果－－－办理办法A、支配历程中浑洗不充分－－－每步浑洗3×5B、构制中含过氧化物酶已阻断－－－可再摆设新陈3%H2O2启关，孵育时间延少C、构制中含内源性死物素－－－仄常非免疫动物血浑再启关D、血浑蛋黑启关不充分－－－延少血浑蛋黑启关时间3、染色强本果－－－办理办法A、抗体浓度过矮，孵育时间过短－－－普及抗体浓度，孵育时间不克不迭少于60分钟B、试剂超出灵验使用期－－－即时调换试剂C、支配中，滴加试剂时慢冲液已沥搞，以致试剂密释－－－每步滴加试剂前沥搞切片中多余的慢冲液（然而预防切片搞燥）D、室温太矮，矮于15℃－－－若室温矮于15度，要改搁正在37℃孵育箱孵育30-60分钟（大概4℃冰箱过夜）E、蛋黑启关过分－－－启关时间不要超出10分钟4、染色阳性本果－－－办理办法A、支配步调过得－－－重新考查，创制阳性对付照B、构制中无抗本－－－创制阳性对付照片，以考证据验截止C、一抗与二抗种属对接过得－－－小心决定一抗与二抗种属无误【请教】免疫组化阳性、阳性对付照的问题诸位大虾，尔搞了大鼠构制的TNF-α免疫组化，是与材后支到医院病理科出钱代搞的，现HE战免疫组化片子已经搞好，尔才意识到不阳性战阳性对付照，请问那二种对付照该怎么弄，是尔自己设念子仍旧该病理科控制给尔创制？需要尔自己再买相映的试剂吗？往日不搞过，所以一头雾火，请不吝见教，多开!免疫组化的共一批片子中要有阳性对付照战阳性对付照才蓄意思,那些该当是共时做出去的,事后无法补救.阳性对付照片正在买试剂时不妨央供附二弛试剂公司的阳性片子,如果不,也不妨自已搞,尔搞的时间是用肿瘤构制做阳性对付照,真验动物构制不加一抗做阳性对付照,您不妨根据自己的真验创制阳性对付照,不必再买买试剂.部分睹解,期视对付您有助闲.免疫组化染色中的对付照片的树坐非常要害，它是推断您的染色是可乐成的关键依据，而且也是检测每一个抗体的品量尺度，常设的对付照如下：自己对付照、阳性对付照（空黑对付照、代替对付照、压制对付照、吸支真验对付照）、阳性对付照.A、自己对付照：正在共十足片上与检测的手段物对付照比较.如Actin、CD34正在仄常构制中的血管壁肌层应为阳性，Vimentin不妨间量细胞，Desmin以血管壁及肌束为对付照，S-100以小神经终为对付照等，如果应为阳性的构制是阳性，则技能支配精确，如为阳性，则标明技能大概免疫试剂品量有问题.B、空黑对付照：用慢冲液代替一抗.C、代替对付照：用非免疫血浑代替一抗.D、压制对付照：使用与一抗相共的非标记表记标帜抗体密释特同性一抗，适于间接法.E、吸支真验对付照：已知抗本与相映的第一抗体混同，爆收分离重淀，再用此重淀抗体复合物举止免疫组化真验，截止为阳性.F、阳性对付照：用以含有靶抗本的切片举止对付照.开开楼上二位仁兄的关切指面！。
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免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置
问题：免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置？
参考见解1：阳性对照：已知含有要测的抗原的组织。
阴性对照：可以做几种：空白对照：免去一抗
代替对照：免疫前血清代替一抗
已知阴性组织
抑制试验：未标记抗体
要发文章建议做代替对照。
参考见解2：
楼上回答的真好，不过组织内对照的合理使用可以免去设置实验对照的很多麻烦！
问题：免疫组化技术(IHC)的优点是什么
参考见解：
1．特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2．敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。
3．定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。
免疫组化常见问题的处理
参考意见：
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
①是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
处理的方法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。
另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常
0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。
特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥DBA的使用是否正确。
DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒
时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。
另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
1、染色过强
原因－－－解决办法
A、抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长－－－降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
B、孵育温度过高，孵育温度超过37℃－－－一般室温20-28℃
C、DAB显色时间过长或DAB浓度过高－－－显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因－－－解决办法
A、操作过程中冲洗不充分－－－每步冲洗3×5
B、组织中含过氧化物酶未阻断－－－可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
C、组织中含内源性生物素－－－正常非免疫动物血清再封闭
D、血清蛋白封闭不充分－－－延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因－－－解决办法
A、抗体浓度过低，孵育时间过短－－－提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
B、试剂超过有效使用期－－－及时更换试剂
C、操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释－－－每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
D、室温太低，低于15℃－－－若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
E、蛋白封闭过度－－－封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因－－－解决办法
A、操作步骤错误－－－重新试验，设立阳性对照
B、组织中无抗原－－－设立阳性对照片，以验证实验结果
C、一抗与二抗种属连接错误－－－仔细确定一抗与二抗种属无误
【请教】免疫组化阳性、阴性对照的问题
各位大虾，我做了大鼠组织的TNF-α免疫组化，是取材后送到医院病理科出钱代做的，现HE和免疫组化片子已经做好，我才意识到没有阳性和阴性对照，请问这两种对照该怎么弄，是我自己想办法还是该病理科负责给我设立？需要我自己再买相应的试剂吗？以前没有做
过，所以一头雾水，请不吝赐教，多谢!
免疫组化的同一批片子中要有阳性对照和阴性对照才有意义,这些应该是同时作出来的,事
后无法补救.
阳性对照片在购试剂时可以要求附两张试剂公司的阳性片子,如果没有,也可以自已搞,我做的时候是用肿瘤组织作阳性对照,实验动物组织不加一抗作阴性对照,你可以根据自己的实
验设立阳性对照,不用再购买试剂.
个人见解,希望对你有帮助.
免疫组化染色中的对照片的设置非常重要，它是判断您的染色是否成功的关键依据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下：自身对照、阴性对照（空白对照、替代对照、抑制对照、吸收实验对照）、阳性对照。
A、自身对照：在同一切片上与检测的目的物对照比较。
如Actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，Vimentin可以间质细胞，Desmin以血管壁及肌束为对照，S-100以小神经末为对照等，如果应为阳性的组织是阳性，则技术操作正确，如为阴性，则表明技
术或免疫试剂质量有问题。
B、空白对照：用缓冲液替代一抗。
C、替代对照：用非免疫血清替代一抗。
D、抑制对照：使用与一抗相同的非标记抗体稀释特异性一抗，适于直接法。
E、吸收实验对照：已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合
物进行免疫组化实验，结果为阴性。
F、阳性对照：用以含有靶抗原的切片进行对照。
谢谢楼上两位仁兄的热心指点！。