女性Ⅱ型糖尿病患者尿液菌群特征与非感染性下尿路症状的关系

临床泌尿外科杂志2018年JC l i nU r o l o g y (C h i n a )33卷1期女性Ⅱ型糖尿病患者尿液菌群特征与非感染性下尿路症状的关系陈嘉炜1 曹瑛2 陈杨1 高方2 张桂豪1 李颖2 吴芃1*基金项目:广东省科技计划项目(编号2014A 020212195);广东省自然科学基金(编号2016A 030313605)1南方医科大学南方医院泌尿外科(广州,510515)2南方医科大学南方医院内分泌代谢科通信作者:吴芃,E -m a i l :d o c t o r w u p e n g@g m a i l .c o m [摘要] 目的:比较出现非感染性下尿路症状(n o n -i n f e c t i o u s l o w e ru r i n a r y t r a c t s y m pt o m s ,n o n -i L U T S )对女性Ⅱ型糖尿病(d i a b e t e sm e l l i t u s ,D M )患者尿液菌群的影响,探讨该类患者潜在的菌属标志物㊂方法:确诊为Ⅱ型D M 的女性患者纳入D M 组,同期健康女性纳入对照组㊂两组均完成美国泌尿科协会症状指数问卷(A m e r i c a nU r o l o g i c a lA s s o c i a t i o nS y m p t o mI n d e xQ u e s t i o n n a i r e ,A U A -S I )㊂样本通过清洁中段尿的方法留取并进行D N A 提取㊂I l l u m i n a 测序平台进行扩增和高通量测序㊂原始数据导入Q I I M E 分析样本微生物的α和β多样性㊂L E f S e 分析不同分组间属水平上具有显著差异的细菌㊂结果:D M 组和对照组剔除序列数过少的参与者后分别为19例和20例,除了体重指数外,两组的人口学特征差异无统计学意义(P >0.05)㊂D M 组尿液菌群的C h a o 1指数和O b s e r v e d s p e c i e s 低于对照组(P <0.01),提示D M 组菌群丰富度低于对照组;香农和辛普森指数提示两组菌群多样性差异无统计学意义(P >0.05);β多样性提示两组菌群结构差异有统计学意义(P <0.01);L E f S e 提示D M 组有3个菌属的相对丰度升高,9个菌属的相对丰度下降㊂D M 伴下尿路症状组尿液菌群中有6个菌属相对丰度显著高于不伴下尿路症状组,两组的α和β多样性差异均无统计学意义(P >0.05)㊂结论:女性D M 患者与健康女性的尿液菌群结构存在显著差异,当女性D M 患者出现n o n -i L U T S 时,尿液菌群进一步发生改变㊂[关键词] 糖尿病;下尿路症状;尿液菌群d o i :10.13201/j.i s s n .1001-1420.2018.01.004[中图分类号] R 694 [文献标识码] A R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c h a r a c t e r i s t i c s o f u r i n a r y mi c r o b i o m e a n dn o n -i n f e c t i o u s l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m s i n f e m a l e t y peⅡd i a b e t i c p a t i e n t s C H E NJ i a w e i 1 C A OY i n g 2 C H E NY a n g 1 G A OF a n g2Z HA N GG u i h a o 1 L IY i n g 2 WU P e n g1(1D e p a r t m e n to fU r o l o g y ,N a n f a n g H o s p i t a l ,S o u t h e r n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,G u a n gz h o u ,510515,C h i n a ;2D e p a r t m e n t o f E n d o c r i n o l o g y ,N a n f a n g H o s p i t a l ,S o u t h e r nM e d i c a lU n i v e r s i t y)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :WU P e n g ,E -m a i l :d o c t o r w u p e n g@g m a i l .c o m A b s t r a c t O b je c t i v e :T oc o m p a r e t h ed if f e r e n c eo fu r i n a r y m i c r o b i o m eb e t w e e nt y p e Ⅱd i a b e t i cw o m e nw i t h n o n -i n f e c t i o u s l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m s (n o n -i L U T S )a n dw i t h o u t o f t h a t a n d t o e x pl o r e t h e p o t e n t i a l b i o m a r -k e r sw h e nd i a b e t i cw o m e n s u f f e r i n g f r o mt h i s d i s o r d e r .M e t h o d :W o m e n t h a t d i a g n o s e dw i t h t y pe Ⅱd i a b e t e sm e l l i -t u s (D M )a n dh e a l t h yf e m a l ev o l u n t e e r sw e r e r e c r u i t e da n da s k e dt o f i n i s ht h eA m e r i c a n U r o l o gi c a lA s s o c i a t i o n S y m p t o mI n d e x q u e s t i o n n a i r e (A U A -S I ).U r i n es p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e df r o mc l e a nc a t c h m i d s t r e a m u r i n ea n d p r o c e s s e d f o r e x t r a c t i n g D N A.M i c r o b i a l d i v e r s i t y a n dc o m p o s i t i o n w e r ea n a l y z e du s i n g t h e I l l u m i n as e q u e n c i n gp l a t f o r mt a r g e t i n g t o 16S r D N A g e n e .S e q u e n c i n g r e a d sw e r e p r o c e s s e db y QI I M E .G e n u s t h a t h a dd i f f e r e n c e i n r e l a t i v e a b u n d a n c e a m o n gg r o u p sw e r e i d e n t i f i e db y L E f S e a l g o r i t h m.R e s u l t :A f t e r s c r e e n i n g ,19a n d20p a r t i c i -p a n t sw e r e e n r o l l e di nD M g r o u p a n dc o n t r o l g r o u p r e s p e c t i v e l y .T h e r ew a sn os i gn i f i c a n td i f f e r e n c e i nd e m o -g r a p h i c c h a r a c t e r i s t i c s b e t w e e nD M g r o u p a n d c o n t r o l g r o u p e x c e p t B o d y M a s s I n d e x (P >0.05).C h a o 1i n d e x a n d O b s e r v e d s p e c i e s i nD M g r o u p w e r e l o w e r t h a n t h o s e i n c o n t r o l g r o u p,w h i c h i n d i c a t e d t h a t r i c h n e s s o fm i c r o b i o m e w a s l o w e r i nD M g r o u p (P <0.01).N os i g n i f i c a n t s t a t i s t i cd i f f e r e n c ew a s f o u n db e t w e e nt h e s et w o g r o u ps i n S h a n n o n a n dS i m p s o n i n d e x ,w h i c h i n d i c a t e d t h a t n od i f f e r e n c e a b o u t b a c t e r i a l d i v e r s i t y wa s f o u n db e t w e e n t h e s e t w o g r o u p s (P >0.05).β-d i v e r s i t y s h o w e d t h a t s i g n i f ic a n td i f fe r e n c e of b a c t e r i a l c o m p o s i t i o nw a s f o u n db e t w e e n t h e s e t w og r o u p (P <0.01).A m o n g th eu ri n a r y m i c r o b i o m e i nD M g r o u p,t h r e eb a c t e r i a s r e l a t i v ea b u n d a n c e i n c r e a s e dw h i l en i n eb a c t e r i a sr e l a t i v ea b u n d a n c ed e c r e a s e d .T h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i nα-d i v e r s i t ya n d β-d i v e r s i t yb e t w e e nD M w i t h l o w e r u r i n a r y t r ac t s y m p t o m g r o u p a n dD M w i t h o u t l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m g r o u p (P >0.05).A m o n g t h e u r i n a r y m i c r o b i o m e i nD M w i t h l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m g r o u p,s i x b a c t e r i a s ㊃61㊃r e l a t i v e a b u n d a n c e i n c r e a s e d.C o n c l u s i o n:S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew a s f o u n d i n t h e c o m p o n e n t o f u r i n a r y m i c r o b i o m e b e t w e e n f e m a l e d i a b e t i c p a t i e n t s a n dh e a l t h y c o n t r o l s.T h eu r i n a r y m i c r o b i o m e f u r t h e r c h a n g e dw h e n f e m a l ed i a-b e t i c p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o mn o n-i L U T S.K e y w o r d s d i a b e t e sm e l l i t u s;l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m s;u r i n a r y m i c r o b i o m e随着人口老龄化和饮食结构的改变,糖尿病(d i a b e t e sm e l l i t u s,D M),特别是Ⅱ型D M的患病率在世界范围内迅速增加 1 ㊂据统计,约80%的D M患者会出现下尿路症状(l o w e ru r i n a r y t r a c t s y m p t o m s,L U T S) 2 ,虽然L U T S不像D M其他并发症那样能够威胁人们的生命,但它却能严重影响患者的生活质量 3 ㊂传统观点认为健康个体的尿液是无菌的,但近来一些研究通过对16Sr D N A 高通量测序证实健康个体的尿液也存在着各种各样的细菌 4,5 ,并且不同的疾病会影响尿液菌群的特征,例如我们前期的研究发现膀胱过度活动症患者存在多样性和丰富度异常的尿液菌群 6 ;间质性膀胱炎患者的尿液中细菌的种类减少并且乳杆菌属的比例升高 7 ;急迫性尿失禁患者的尿液中加德纳菌属的比例升高而乳杆菌属的比例下降 8 ㊂D M是泌尿系感染的危险因素,发生泌尿系感染的D M患者会出现L U T S,但有部分缺乏泌尿系统感染证据D M患者也会出现L U T S㊂D M患者出现非感染性下尿路症状(n o n-i n f e c t i o u s l o w e r u r i n a r y t r a c t s y m p t o m s,n o n-i L U T S)的发病机制十分复杂,目前尚未完全明确,其中可能涉及了血管㊁神经㊁膀胱逼尿肌等多个方面,许多患者对常规治疗的疗效并不满意㊂因此,需要对D M并发n o n-i L U T S的发病机制和新治疗靶点进一步研究㊂本研究旨在研究女性D M患者的尿液菌群特征,探讨D M并发n o n-i L U T S时潜在的菌属标志物㊂1资料与方法1.1临床资料2017年5月~2017年10月我院确诊为Ⅱ型D M的女性患者纳入为D M组,纳入标准:①成年女性;②诊断为Ⅱ型D M 9 ;③尿常规或尿培养阴性;④近1个月未使用抗生素;⑤无可能影响排尿的基础疾病,例如泌尿生殖道解剖异常㊁神经系统疾病㊁药物滥用等㊂对照组为同期的健康志愿者,纳入标准:①成年女性;②无明确的泌尿系统疾病和症状;③尿常规或尿培养阴性;④近1个月未使用抗生素㊂所有受试者均签署知情同意书㊂1.2方法1.2.1量表填写美国泌尿科协会症状指数问卷(A m e r i c a nU r o l o g i c a l A s s o c i a t i o nS y m p t o mI n d e x Q u e s t i o n n a i r e,A U A-S I)㊂1.2.216Sr D N A高通量测序采用清洁中段尿的方法留取尿液标本50m l,其中20m l用于细菌标准培养排除泌尿系感染,剩下的30m l尿液标本4ħ保存,1h内送往实验室,16000g离心10m i n,沉淀-80ħ保存㊂D N e a s y B l o o d&T i s s u e试剂盒提取尿液中的D N A并用分光光度计检测质量㊂V4区通用引物进行16Sr D N A的P C R扩增并构建文库,I l l u m i n a平台对文库进行D N A测序㊂1.2.3生物信息数据分析原始数据导入Q I-I M E软件进行质量过滤,U C L U S T方法将序列聚类为操作分类单位(o p e r a t i o n a l t a x o n o m i cu n i t s, O T U),B l a s t法对比S I L V A和G r e e n g e n e s数据库进行物种分类注释㊂基于O T U的分析结果,进行样品微生物α和β多样性分析㊂其中α多样性中的O b s e r v e ds p e c i e s和C h a o1指数表示菌群的丰富度,香农指数和辛普森指数表示菌群的多样性㊂基于u n w e i g h t e du n i f r a c距离得到矩阵(β多样性),运用R软件进行主坐标分析和三维图可视化㊂利用L E f S e在线工具K r u s k a l-W a l l i s检验和W i l c o x o n检验鉴别显著差异的菌属,线性判别分析阈值为3.0㊂1.3统计学方法采用S P S S22.0统计软件对数据进行处理㊂计量资料采用M a n n-W h i t n e y U或t检验分析;计数资料采用卡方检验或F i s h e r精确检验分析㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果本研究一共纳入女性Ⅱ型D M患者和健康志愿者各25例,其中6例患者和5例健康志愿者因测序所得的序列数量过少而被排除㊂在剩余的参与者中,除体重指数外,D M组与对照组的人口学特征比较差异无统计学意义(表1)㊂表1D M组与对照组一般资料和症状评分比较例(%),x-ʃs 项目D M组(n=19)对照组(n=20)P值年龄/岁57.5ʃ8.0254.4ʃ6.350.20 B M I/k g㊃m-223.5ʃ4.4319.9ʃ2.76<0.05已婚19(100)20(100)>0.05已育19(100)20(100)>0.05雌激素使用史00>0.05绝经前5(26)4(20)0.72高血压病史6(32)5(25)0.73 A U A-S I8.0ʃ8.152.0ʃ1.62<0.05 <7分11(58)20(100)<0.05 ȡ8分8(42)0<0.05D M组得到的平均序列数为44964.00ʃ㊃71㊃陈嘉炜,等.女性Ⅱ型糖尿病患者尿液菌群特征与非感染性下尿路症状的关系第1期18197.53,对照组得到的平均序列数为98087.85ʃ35946.74㊂D M组平均获得(506.63ʃ367.11)个O T U,对照组平均获得(1754.85ʃ858.35)个O T U,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2㊂表2D M组和对照组尿液菌群的α多样性对比x-ʃs 项目D M组对照组P值O T U506.63ʃ367.111754.85ʃ858.35<0.01 O b s e r v e ds p e c i e s446.05ʃ332.171136.45ʃ694.26<0.01 C h a o1指数643.00ʃ473.871849.58ʃ969.77<0.01香农指数3.87ʃ1.374.74ʃ1.860.095辛普森指数0.79ʃ0.130.82ʃ0.150.273 D M组和对照组尿液菌群的α多样性指数见表2,D M组的C h a o1指数和O b s e r v e ds p e c i e s显著低于对照组(P<0.01),提示D M组尿液菌群的丰度低于对照组;D M组的香农指数㊁辛普森指数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),提示D M组和对照组尿液菌群的多样性无明显差异㊂两组的主坐标分析三维图见图1(基于u n w e i g h t e d u n i f r a c距离),大部分D M组和对照组尿液样本被明显区分,两组比较差异有统计学意义(基于A N O S I M,P<0.01)㊂D M组和对照组的LE f S e分析结果见图2, D M组韦荣球菌属㊁巨球型菌属和F a e c a l i b a c t e r i-u m属的相对丰度升高;黄质菌属㊁卟啉单胞菌属㊁弯曲菌属㊁代尔夫特菌属㊁P e p t o n i p h i l u s属㊁WA L_ 1855D属㊁J o n q u e t e l l a属㊁梭菌属和乳杆菌属的相对丰度降低㊂根据A U A-S I得分,我们把A U A-S I 评分<7分的患者(11例)归入D M不伴L U T S组(n D L组),评分ȡ8分的患者(8例)归入D M伴L U T S组(D L组) 10 ㊂n D L组和D L组的人口学特征比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂D L组和n D L组的α多样性和β多样性比较差异均无统计学意义(P>0.05)㊂D L组和n D L组的L E f S e分析结果见图3,D L组戈登氏菌属㊁A q u a b a c t e r属㊁奇异球菌属㊁G e m m a t a属㊁乳球菌属和根瘤菌属的相对丰度升高㊂3讨论微生物是影响人类健康的重要因素 11 ㊂以往关于肠道微生物的研究表明,肠道菌群的改变可能参与了某些肠道疾病(克罗恩病㊁溃疡性结肠炎等)和代谢疾病(肥胖㊁D M等)的发病 12 ㊂以往认为正常的泌尿道是无菌的,一旦培养出足够数量的细菌(中段尿常规培养菌落数>105C F U/m l),即可认为存在泌尿道感染㊂但随着高通量测序和特殊培图1D M组和对照组的主坐标分析三维图图2D M组与对照组基于L E f S e分析的属水平上尿液菌群的相对丰度比较图3D L组和n D L组基于L E f S e分析的属水平上尿液菌群的相对丰度比较养技术的发展,在 无菌 的尿液中也发现了细菌的存在 13 ,并且不同的疾病状态下,泌尿道细菌的特征会随之发生改变 6~8 ,泌尿道微生物与泌尿系疾病的关系是目前国外研究的热点 13 ㊂L U T S是D M常见的并发症㊂虽然部分出现L U T S的D M患者能够发现泌尿系感染的证据,但仍然有部分非泌尿系感染的D M患者出现L U T S㊂由于缺乏对D M并发n o n-i L U T S发病机制的认识,这部分患者的治疗效果往往不能让人满意㊂长期高血糖状态引起的尿量增多㊁尿液中葡萄糖含量升高以及糖尿病肾病使尿液蛋白含量增加等都会改变尿液微环境,从而引起尿液菌群的改变㊂L i u㊃81㊃临床泌尿外科杂志第33卷等 14 对D M患者的尿液进行16Sr D N A高通量测序发现D M患者尿液菌群的辛普森指数和香农指数低于健康对照组,C h a o1指数也低于健康对照组㊂我们研究发现,D M组尿液菌群的丰富度低于对照组,而多样性却无明显差异,这可能是由于本次试验纳入人数较少引起的,在未来的试验中需要扩大样本量,提高检验效能㊂在D M组的尿液菌群中,我们发现有3种菌属的相对丰度升高,9种菌属的相对丰度下降,其中相对丰度下降的乳杆菌属被认为是有利于人类健康的菌属㊂正常成年女性的阴道中乳酸杆菌可以通过分泌乳酸使阴道的处于酸性状态从而抑制病原菌的生长,防止细菌性阴道炎的发生㊂在泌尿道中,高比例的乳杆菌被认为同样发挥着保护作用 8,15 ㊂动物研究发现,D M动物造模成功3周后开始出现膀胱病变 16 ,我们推测D M患者在出现D M的初期就会出现尿液菌群的紊乱,特别是具有保护性质的乳杆菌属细菌减少,这些患者随着时间的推移逐渐出现n o n-i L U T S,尿液菌群紊乱可能在其发生发展过程中发挥着重要的作用㊂虽然在D M组中还存在其他菌属细菌的异常,但尚待更深入的研究明确其对疾病发生发展的作用㊂未来通过进一步研究,这些菌属可能作为D M并发n o n-i L U T S时的治疗靶点㊂我们通过A U A-S I的得分把纳入研究的患者分为D L组和n D L组2个亚组,并分析其尿液菌群的特征㊂研究发现两组间尿液菌群的丰富度和多样性无显著性差异,但D L组有6种菌属的相对丰度高于n D L组,这6种菌属可能作为早期筛选D M并发n o n-i L U T S的生物标志物,为早期干预提供依据㊂本研究中存在着一些缺陷㊂首先,本研究为横断面研究,通过检测单一时间点受试者的尿液菌群的特征,因此得到的结果无法用于解释各变量间的因果关系㊂其次,16Sr D N A测序只能精确到属级别,其准确度不如宏基因组测序,但是尿液中菌群的丰富度低,16S r D N A测序可能更适合于尿液菌群的测定 13 ㊂本研究采用A U A-S I对患者进行分组,由于A U A-S I主要是针对前列腺增生患者的L U T S进行编制的,未来的研究应该采用专门针对女性L U T S的量表进行分组,甚至采用侵入性的方法获得临床数据进行分组㊂采用清洁中段尿的方法来采集样本,尿液通过尿道或接触皮肤时可能会引入杂菌,影响测试结果㊂最后,在未来的研究中有待扩大样本量减少偏倚,进行多中心研究减少选择偏倚并由专门的受训人员进行问卷提问减少回忆偏倚㊂综上所述,女性D M患者与健康女性的尿液菌群结构存在显著差异,当女性D M患者出现n o n-i L U T S时,尿液菌群进一步发生改变㊂某些菌属可能参与了n o n-i L U T S的发生发展,并可能成为生物标志物和治疗靶点㊂[参考文献]1K i r s c h n e r-H e r m a n n sR,D a n e s h g a r iF,V a h a b iB,e t a l.D o e sd i a b e t e s m e l l i t u s-i n d u c e db l a d d e rr e m o d e l i n g a f-f e c tl o w e r u r i n a r y t r a c tf u n c t i o n?I C I-R S2011[J]. 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