成人脂肪来源间充质干细胞的分离培养与鉴定
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CD55 81. 6% , CD59 98. 6% , CD105 98. 0% , CD166 32. 1% , CD14 0% , CD45 0% , CD34 85. 7% , HLA 2DR 0% , 与国外文献 一致. 油红 O 染色 、碱性磷酸酶染色 、II型胶原染色阳性 、肌
收稿日期 : 2005202225; 接受日期 : 2005205227 作者简介 :李战强. 主治医师. Tel: ( 010 ) 66350528 Email: lizhanqiang
2042 - 2043. [ 3 ] 刘桂英 ,杨立业 ,郑佳坤 ,等. 来源于脂肪组织的基质细胞向成
骨细胞分化 [ J ]. 实用口腔医学杂志 , 2003, 19 (6) : 554 - 557. [ 4 ] 鞠晓东 ,娄思权 ,田 华 ,等. 脂肪间充质干细胞的基本生物学
特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究 [ J ]. 中华实验外科杂 志 , 2004, 21 ( 6) : 654 - 656. [ 5 ] 陈光辉 ,王 燕 ,李天德 ,等. 自成人脂肪组织分离与培养间充 质干细胞的实验研究 [ J ]. 解放军医学杂志 , 2004, 29 ( 6 ) : 510 -
【参考文献 】 [ 1 ] 陈希哲 ,林云锋 ,乔 鞠 ,等. 人体脂肪基质细胞分离培养及其 成骨潜能 [ J ]. 实用口腔医学杂志 , 2004, 20 (1) : 12 - 15. [ 2 ] 余方圆 ,卢世璧 ,袁 枚 ,等. 兔脂肪干细胞的分离培养及定向 诱导为软骨细胞的实验观察 [ J ]. 中国临床康复 , 2004, 8 ( 11 ) :
512. 编辑 潘伯荣
© 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
50 μmol/L氢化可的松
1 实验资料 试剂均购自 Sigma 公司 ,荧光标记单抗购自 BD公司 , DM EM 购自 Gibco公司. 成年女性 48岁行吸脂术时 用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织 20 mL. 在 1 h内将 其移至离心管内 ,加入等量 PBS缓冲液 ,充分振荡后低速离心 800 r/m in ×10 m in. 反复冲洗 3次后加入等量 15 g/L I型胶 原酶. 37℃水 浴 中 充 分 振 荡 30 m in, 再 加 入 等 量 胎 牛 血 清 ( FBS)中止. 低速离心 10 m in 后弃去上清. 将下层细胞用 PBS悬浮后加入 16 mmol/L NH4 Cl 37℃水浴中 10 m in以裂解 红细胞. 低速离心 10 m in后再用 PBS冲洗 3次. 最后将瞎胞 用含 100 mL /L FBS + 10 g/L 青霉素的 DM EM 悬浮后移入培 养瓶中 , 37℃, 50 mL /L CO2 培养箱中孵育 , 48 h后首次换液 , 弃去悬浮细胞. 随后每 3 d换液 , 1 wk后传代. 将第 3代细胞 用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到 109 /L 后按文献所述方法 进行流式细胞仪检测. 细胞传至第 3代时将其以 2 ×107 /L的 细胞数分别转入各定向培养基 (表 1)中进行培养. 诱导培养 2 wk后 ,对成脂诱导组进行油红 O 脂肪颗粒染色 ,对成骨诱 导组进行碱性磷酸酶组化染色 ,对成软骨诱导组进行 II型胶 原染色 ,对成肌诱导组进行肌浆球蛋白组化染色. 结果 :观察 2 d细胞贴壁. 倒置显微镜下见细胞为大而扁平的单层细胞. 有的细胞体细长 ,似成纤维细胞. 流式细胞仪图上为单一群 体细胞. 免疫表型 : CD10 69. 8% , CD13 99. 2% , CD29 91. 0% ,
@ vip. sohu. net
2 讨 论 脂 肪 来 源 的 干 细 胞 ( adipose tissue2derived stem cells)虽然具备干细胞的一些特性 ,但还不能将其称为脂肪干 细胞 ,因为其中可能含有不同分化阶段的脂肪前体细胞 (p rea2 dipocyte). 从这个意义上讲 ,将其称为脂肪基质细胞 ( adipose tissue2derived stromal cells)更为适合 [1 - 3 ]. 目前在干细胞研究 领域均公认 ,间充质干细胞没有特异的表面标志. 免疫组化 染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认干细胞有辅 助作用. 而鉴定干细胞的最好方法是进行多系定向诱导 ,并 进行相应检测以确定诱导成功. 而在一些文献中以偏概全 , 通过少数几个 CD分子的免疫组化染色的阳性结果而下结论 说所分离出的细胞是干细胞是不可取的 [4 - 5]. 本研究参照 Zuk等 [1 ]的方法进行细胞分离培养 ,并通过免疫表型和功能 诱导 2个方向的实验 ,取得了与文献相一致的结果 ,一方面说 明此种方法具备稳定的可操作性 ,另一方面也充分说明所分 离培养的脂肪基质细胞中确实含有多向分化潜能的间充质干 细胞.
100 mL /L
100 mL /L
10 mL /L 100 mL /L HS ( 50 mL /L )
其他成份
0. 5 mmol/L 1, 32异丁基甲基黄嘌呤 ( IBMX) 10 μmol/L地塞米松 , 10μmol/L胰 岛素 , 200μmol/L消炎痛 0. 1 μmol/L地塞米松 , 50μmol/L抗 坏血酸磷酸钠 , 10 μmol/L β2磷酸甘油 6. 25%mg /L 胰岛素 , 10 μg/L TGF2 β1, 50 nmol/L抗坏血酸磷酸钠
[ 11 ] W alm sley AM , Am tzen CJ. Plants for delivery of edible vaccines
[ J ]. Curr Op in B iotechnol, 2000, 11: 126 - 130.
[ 12 ] Singh M , Cattaneo R, B illeter MA , et al. A recombinant measles
培养室 ,3 军事医学科学院细胞与基因治疗 中 心 , 北 京 100011)
【关键词 】成人 ;脂肪 ;干细胞 ;分离 ;培养 【中图号 】R318. 12 【文献标识码 】B
表 1 含 10 g /L青霉素的定向诱导培养基 DM EM 成份
Fra Baidu bibliotek
定向 对照 成脂 成骨 成软骨 成肌肉
FB S 100 mL /L
编辑 甄志强
·经验交流 · 文章编号 : 100022790 (2006) 0120052201
浆球蛋白染色分别呈阳性.
成人脂 肪 来 源 间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养与鉴定
李战强 1 ,黄友章 2 ,彭勤建 1 ,汪立川 1 , 解永学 1 , 廖 丽 3 (1 北京黄寺美容外科医院外科 , 2 海军总医院血液细胞
virus exp ressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral
immune responses in genetically modified m ice [ J ]. V irology,
1999, 73 ( 6) : 4823 - 4828.
52
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (1) http: / / journal. fmmu. edu. cn
mediated cytotoxicity in HLA 2A2 transgenic m ice [ J ]. World J Gas2 troenterol, 2004, 10 ( 8) : 1222 - 1226. [ 9 ] Chen XC, L i XZ, Le XH , et al. Recombinant hepatitis B core anti2 gen carrying p reS1 ep itopes induce immune response against chornic HBV infection [ J ]. Vaccine, 2004, 22 ( 7) : 2878 - 2885. [ 10 ] W en YM , Qu D , Zhou SH, et al. Antigen2antibody comp lex as ther2 apeutic vaccine for viral hepatitis B [ J ]. Int Rev Immunl, 1999, 18 ( 3) : 251 - 260.
收稿日期 : 2005202225; 接受日期 : 2005205227 作者简介 :李战强. 主治医师. Tel: ( 010 ) 66350528 Email: lizhanqiang
2042 - 2043. [ 3 ] 刘桂英 ,杨立业 ,郑佳坤 ,等. 来源于脂肪组织的基质细胞向成
骨细胞分化 [ J ]. 实用口腔医学杂志 , 2003, 19 (6) : 554 - 557. [ 4 ] 鞠晓东 ,娄思权 ,田 华 ,等. 脂肪间充质干细胞的基本生物学
特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究 [ J ]. 中华实验外科杂 志 , 2004, 21 ( 6) : 654 - 656. [ 5 ] 陈光辉 ,王 燕 ,李天德 ,等. 自成人脂肪组织分离与培养间充 质干细胞的实验研究 [ J ]. 解放军医学杂志 , 2004, 29 ( 6 ) : 510 -
【参考文献 】 [ 1 ] 陈希哲 ,林云锋 ,乔 鞠 ,等. 人体脂肪基质细胞分离培养及其 成骨潜能 [ J ]. 实用口腔医学杂志 , 2004, 20 (1) : 12 - 15. [ 2 ] 余方圆 ,卢世璧 ,袁 枚 ,等. 兔脂肪干细胞的分离培养及定向 诱导为软骨细胞的实验观察 [ J ]. 中国临床康复 , 2004, 8 ( 11 ) :
512. 编辑 潘伯荣
© 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
50 μmol/L氢化可的松
1 实验资料 试剂均购自 Sigma 公司 ,荧光标记单抗购自 BD公司 , DM EM 购自 Gibco公司. 成年女性 48岁行吸脂术时 用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织 20 mL. 在 1 h内将 其移至离心管内 ,加入等量 PBS缓冲液 ,充分振荡后低速离心 800 r/m in ×10 m in. 反复冲洗 3次后加入等量 15 g/L I型胶 原酶. 37℃水 浴 中 充 分 振 荡 30 m in, 再 加 入 等 量 胎 牛 血 清 ( FBS)中止. 低速离心 10 m in 后弃去上清. 将下层细胞用 PBS悬浮后加入 16 mmol/L NH4 Cl 37℃水浴中 10 m in以裂解 红细胞. 低速离心 10 m in后再用 PBS冲洗 3次. 最后将瞎胞 用含 100 mL /L FBS + 10 g/L 青霉素的 DM EM 悬浮后移入培 养瓶中 , 37℃, 50 mL /L CO2 培养箱中孵育 , 48 h后首次换液 , 弃去悬浮细胞. 随后每 3 d换液 , 1 wk后传代. 将第 3代细胞 用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到 109 /L 后按文献所述方法 进行流式细胞仪检测. 细胞传至第 3代时将其以 2 ×107 /L的 细胞数分别转入各定向培养基 (表 1)中进行培养. 诱导培养 2 wk后 ,对成脂诱导组进行油红 O 脂肪颗粒染色 ,对成骨诱 导组进行碱性磷酸酶组化染色 ,对成软骨诱导组进行 II型胶 原染色 ,对成肌诱导组进行肌浆球蛋白组化染色. 结果 :观察 2 d细胞贴壁. 倒置显微镜下见细胞为大而扁平的单层细胞. 有的细胞体细长 ,似成纤维细胞. 流式细胞仪图上为单一群 体细胞. 免疫表型 : CD10 69. 8% , CD13 99. 2% , CD29 91. 0% ,
@ vip. sohu. net
2 讨 论 脂 肪 来 源 的 干 细 胞 ( adipose tissue2derived stem cells)虽然具备干细胞的一些特性 ,但还不能将其称为脂肪干 细胞 ,因为其中可能含有不同分化阶段的脂肪前体细胞 (p rea2 dipocyte). 从这个意义上讲 ,将其称为脂肪基质细胞 ( adipose tissue2derived stromal cells)更为适合 [1 - 3 ]. 目前在干细胞研究 领域均公认 ,间充质干细胞没有特异的表面标志. 免疫组化 染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认干细胞有辅 助作用. 而鉴定干细胞的最好方法是进行多系定向诱导 ,并 进行相应检测以确定诱导成功. 而在一些文献中以偏概全 , 通过少数几个 CD分子的免疫组化染色的阳性结果而下结论 说所分离出的细胞是干细胞是不可取的 [4 - 5]. 本研究参照 Zuk等 [1 ]的方法进行细胞分离培养 ,并通过免疫表型和功能 诱导 2个方向的实验 ,取得了与文献相一致的结果 ,一方面说 明此种方法具备稳定的可操作性 ,另一方面也充分说明所分 离培养的脂肪基质细胞中确实含有多向分化潜能的间充质干 细胞.
100 mL /L
100 mL /L
10 mL /L 100 mL /L HS ( 50 mL /L )
其他成份
0. 5 mmol/L 1, 32异丁基甲基黄嘌呤 ( IBMX) 10 μmol/L地塞米松 , 10μmol/L胰 岛素 , 200μmol/L消炎痛 0. 1 μmol/L地塞米松 , 50μmol/L抗 坏血酸磷酸钠 , 10 μmol/L β2磷酸甘油 6. 25%mg /L 胰岛素 , 10 μg/L TGF2 β1, 50 nmol/L抗坏血酸磷酸钠
[ 11 ] W alm sley AM , Am tzen CJ. Plants for delivery of edible vaccines
[ J ]. Curr Op in B iotechnol, 2000, 11: 126 - 130.
[ 12 ] Singh M , Cattaneo R, B illeter MA , et al. A recombinant measles
培养室 ,3 军事医学科学院细胞与基因治疗 中 心 , 北 京 100011)
【关键词 】成人 ;脂肪 ;干细胞 ;分离 ;培养 【中图号 】R318. 12 【文献标识码 】B
表 1 含 10 g /L青霉素的定向诱导培养基 DM EM 成份
Fra Baidu bibliotek
定向 对照 成脂 成骨 成软骨 成肌肉
FB S 100 mL /L
编辑 甄志强
·经验交流 · 文章编号 : 100022790 (2006) 0120052201
浆球蛋白染色分别呈阳性.
成人脂 肪 来 源 间 充 质 干 细 胞 的 分 离 培 养与鉴定
李战强 1 ,黄友章 2 ,彭勤建 1 ,汪立川 1 , 解永学 1 , 廖 丽 3 (1 北京黄寺美容外科医院外科 , 2 海军总医院血液细胞
virus exp ressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral
immune responses in genetically modified m ice [ J ]. V irology,
1999, 73 ( 6) : 4823 - 4828.
52
第四军医大学学报 (J Fourth M il M ed Univ) 2006; 27 (1) http: / / journal. fmmu. edu. cn
mediated cytotoxicity in HLA 2A2 transgenic m ice [ J ]. World J Gas2 troenterol, 2004, 10 ( 8) : 1222 - 1226. [ 9 ] Chen XC, L i XZ, Le XH , et al. Recombinant hepatitis B core anti2 gen carrying p reS1 ep itopes induce immune response against chornic HBV infection [ J ]. Vaccine, 2004, 22 ( 7) : 2878 - 2885. [ 10 ] W en YM , Qu D , Zhou SH, et al. Antigen2antibody comp lex as ther2 apeutic vaccine for viral hepatitis B [ J ]. Int Rev Immunl, 1999, 18 ( 3) : 251 - 260.