医学微生物学实验：脓汁标本中金黄色葡萄球菌的鉴定
脓汁和粪便标本中病原菌检测实验报告二
脓汁和粪便标本中病原菌的检测年级专业：14临床输血学号： 3140704004姓名：宁立军组别：第七组合作者：牛恺文黄可秀朱晋辉实验室：第六实验室指导老师：罗军实验的得分：一、实验目的通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。
二、实验器材1器材接种环接种针打火机马克笔酒精灯电热恒温培养箱物显微镜电炉试管（带棉塞）称量纸药勺牛皮纸橡皮筋尺子锥形瓶高压蒸汽灭菌器镊子玻片吸水纸2 试剂药品普通营养琼脂培养基蒸馏水脓汁标本粪便标本石蜡油生理盐水结晶紫卢戈碘液 95%乙醇稀释复红葡萄糖微量发酵管（2支）乳糖微量发酵管（2支）青霉素抗菌素纸片链霉素抗菌素纸片庆大霉素抗菌素纸片兔血浆福氏志贺菌诊断血清三、方法与步骤1培养基制备称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮），使完全溶解，趁热分装。
（平板培养基：以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4℃冰箱保存备用。
斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。
）贴上标签后灭菌使用。
2空气与人体体表细菌学检查根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（CFU），了解空气的污染情况。
平板盖打开，盖朝下放在平板旁，琼脂平板暴露15分钟即可。
在普通平板上接种手指上的细菌。
第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。
3细菌分离培养接种前，接种环烧灼灭菌。
取标本在平板表面上方密集涂布5～10 mm²。
烧掉接种环上多余的标本。
冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）。
实验5 金黄色葡萄球菌的检验
实验5 金黄色葡萄球菌的检验1 目的和要求（1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法（2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理2 基本原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。
3 实验材料3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。
3.3 培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。
3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。
4 检样程序5 操作步骤5.15.1.1样品的处理称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。
若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。
5.1.2 增菌和分离培养5.1.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
金黄色葡萄球菌检验
至少观察6h；
☞凝固为阳性。 ☺用阳性表皮菌做对照试验，观察结果。（不凝固）
兔血浆配制：将小支试剂加入粉剂瓶中，摇匀即可。现配现用。
革兰氏染色步骤：
涂片—— 火焰固
定——结晶紫初染——
水洗—— 碘液媒染——
乙醇脱色—— 水洗——
吸干—— 番红或沙黄复 染—— 水洗—— 干燥— — 镜检
• 涂片：在载玻片中央滴一滴生理盐水，用
无菌操作法挑取菌种于生理盐水中，调匀
并涂成薄膜。注意：生理盐水不宜过多；
涂片必须均匀。
• 火焰固定：载玻片通过火焰1 ~ 2 次固定，
不可过热，以载玻片不烫手背为宜。
• 结晶紫初染：涂片置于水平位置。涂片薄
谢 谢
7.5%氯化钠肉汤
分离
从阳性增菌液中用接种环取
1环 BP平板，划线 18~24h或45~48h 1环 血平板，划线 18~24h
36℃±1 ℃
培养
血平板 BP平板
开始处
开始处
平板划线示意图
菌落特征：黑色或灰 色，圆形，光滑凸起， 湿润，周围有一浑浊 带，在其外层有一透 明圈
菌落特征：金黄色， 有时也为白色，大而 凸起，圆形，不透明， 表面光滑、湿润，周 围有透明溶血圈。
从阳性血平板或BP平 板上挑取典型菌落，营 养琼脂斜面划线
于36℃±1℃培养18~24h
从血平板或BP平 板上挑取典型菌落， 加入脑心浸出液 （BHI）肉汤
从血平板或BP平 板上挑取典型菌 落，染色
血浆凝固酶试验
☞用长滴管将新配制的兔血浆移入灭菌小试管中；
☞用吸量管移取0.2~0.3mL脑心浸出液（BHI）肉汤
脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告
2016年秋季学期微生物学实验报告1、了解医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理。
2、熟悉常见病原性球菌及常见肠道致病菌的检查程序，掌握各检查实验操作。
3、了解脓汁和粪便标本中病原菌的检测的临床应用及临床意义。
4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
5、熟悉抗生素对于不同细菌的作用机理。
6、树立牢固的无菌观念。
二、实验器材：1、培养基：营养琼脂平板、伊红美兰平板、斜面、营养肉汤、半固体琼脂2、标本：脓汁标本、粪便标本、空气细菌培养物、手指皮肤细菌培养物、细菌分离培养物、斜面培养物、营养肉汤培养物、药敏试验培养物3、器材：1）培养基的制备：天平、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、试管、试管架、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮纸、橡皮筋、干粉培养基、酒精灯、火机。
2）细菌的分离培养：碘酒棉球，酒精棉球、眼科镊子、接种环。
3）细菌的纯培养: 接种环。
4）细菌的形态学检查：生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、结晶紫染液、芦戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红、染色架、接种环。
5）细菌的生化试验:糖发酵管、抗菌素（青霉素、链霉素、庆大霉素）纸片、眼科镊子、接种针、接种环、小砂轮、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、载玻片。
6）结果分析：尺子。
三、方法与步骤1、营养肉汤培养基的制备取1.1g营养肉汤粉末于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水，摇晃锥形瓶使其几乎完全溶解。
将锥形瓶置于电陶炉上加热至沸腾，观察固体是否完全溶解，冷却后分装至试管内。
2、细菌的分离培养（平板划线分离法）甲→脓汁标本→营养琼脂平板乙→脓汁标本→营养琼脂平板丙→粪便标本→伊红美蓝平板丁→粪便标本→伊红美蓝平板1）接种环烧灼灭菌，以免污染标本。
2）取标本3～5ul。
3）转动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。
4）接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条5）甲、乙烧掉接种环上多余的标本。
〖医学〗脓汁中病原性球菌和粪便中致病性杆菌的鉴定
金
表
黄
皮
色
葡
葡
萄
萄
球
球
菌
菌
观察菌落特点
脓汁标本在血平板上经过24小时的培养，已 经长出菌落，首先观察菌落的特点： • 菌落的形态； • 光滑程度； • 色素的产生情况； • 细菌的溶血情况。
形态学鉴定
革兰染色，观察细菌的染色性状和排列特点。
G-球菌
双球菌 结合临床进行判断
G+菌链状排列或成对排列
新乡医学院 微生物学教研室
凝固酶
❖ 是指能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或 兔的血浆发生凝固的酶类物质。
❖ 致病性葡萄球菌大多能产生凝固酶 ❖ 凝固酶分为两种：游离凝固酶、结合凝固酶
方法
❖ 试管法
适合于游离凝固 酶的检查
❖ 玻片法
适合于结合凝固 酶的检查
试管法凝固酶试验
原理
协同因子
游离凝固酶 类似凝血酶原物质
操作内容
1 革兰染色： 每台2张玻片，染1张球菌和1张杆菌；
2 血浆凝固酶实验： 每台1张玻片；
3 玻片凝集反应： 每台1张玻片；
4 接种双糖铁培养基： 每台2管双糖铁培养基（穿刺+斜面 ）。
观察内容
1 脓汁标本细菌在血平板上的生长现象； 2 肠杆菌在SS平板上生长的菌落特点； 3 肠杆菌在双糖铁培养基上生长的特点。
如果介于12－20mm之间时应重复试验。
结果判断
菌落特点：形态；色素；溶血； 革兰染色的特点：判断形态，排列和染色； 根据溶血判断链球菌的种类；根据生化反应 区别肺炎双球菌和甲链。
G+菌葡萄串状排列
首先观察菌落特点：色素；溶血情况；
进一步鉴定： 血浆凝固酶实验； 耐热核酸酶实验； 甘露醇的发酵
脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告模板一
医学微生物学实验报告姓名___ __________学号___ ________年级___ ____组别__ ______实验名称脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验者合作者日期指导老师一、实验目的1、掌握培养基的制备的原则和一般方法2、掌握细菌的分离培养方法3、掌握油镜的正确使用，细菌标本图片的制备4、掌握细菌的形革兰氏染色法以及形态学检查方法5、熟悉细菌的生化试验方法（糖发酵试验、抗菌素敏感性试验、血浆凝固酶实验、动力学实验）的原理及方法6、掌握玻片凝集试验的原理及方法二、实验器材1、5ml试管15支、托盘天平、锥形瓶、营养肉汤干粉培养基、量筒、使馆狂、酒精灯、洗耳球、刻度吸管2、脓汁标本1支，粪便标本1支、伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个、接种环、酒精灯3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把。
6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤流程图：营养琼脂培养基的制备细菌的分离培养细菌的纯培养细菌形态学检查液体培养基接种细菌的生化实验1、营养肉汤培养基的制备①称取1.1g营养肉汤干粉培养基于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水溶解②加热煮沸1次，加热时需要摇动③分装于15支小试管中，每支3ml④集中放在试管筐中，罩上硫酸纸和牛皮纸，用橡皮筋包扎好⑤灭菌2、细菌的分离培养平板画线法：小组分工：甲→脓汁标本→营养琼脂平板丙→粪便标本→伊红美蓝平板乙→脓汁标本→营养琼脂平板丁→粪便标本→伊红美蓝平板步骤：①点燃酒精灯，把接种环在酒精灯上烧灼灭菌，金属杆快速通过火焰2～3次，以杀灭表面微生物。
②取出标本，在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之，管口迅速通过火焰3次③将冷却的接种环沾取标本1环，管口迅速通过火焰灭菌后塞上棉塞放回。
葡萄球菌的鉴定
血浆凝 固酶
甘露醇 发酵
金葡
表葡
腐生
（4）新生霉素敏感试验
血平板 菌悬液涂布 5ug/L新生霉素纸片 35℃孵育16~18h S:抑菌圈直径>16mm，R:≤16mm
结果 ATCC25923 表葡 S R
腐生
阳性结果 （S）
实验七 葡萄球菌鉴定
检验系微生物教研室
（一）葡萄球菌检验程序
脓液、咽拭子、穿刺液 尿液、痰液脑脊液血液粪便、呕吐 物
直接涂片染色
初报
分离培养 （血平板）
分离培养
增菌培养 （高盐甘露醇 平板）
涂片染色 触媒 血浆凝固酶 甘露醇发酵 耐热核酸酶 其他鉴定试验
取可疑菌落
鉴定试验
药敏试验
报告
（二）目的要求
培养基：血琼脂平板，MH琼脂，甘露醇发酵管 试剂：生理盐水，3%H2O2,EDTA抗凝兔血浆，革兰染液，
新生霉素纸片、头孢西丁、红霉素、克林霉素纸片 其他：酒精灯，接种环，接种针，玻片，显微镜，孵箱等
（四）步骤方法
1.细菌菌落特征观察：
大小 形态 光泽 表面 边缘 透明度 颜色 溶血 金葡 表葡 腐生
玻片法
【操作】取兔血浆和生理盐水各1滴分别滴于载玻 片上，用接种环挑取细菌，混合后观察。
【操作】
试管法
（3）甘露醇发酵试验：
【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类， 能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。
【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经35℃ 孵育18-24h观察结果。
【结果】金葡为阳性，表皮、腐生为阴性
H2O2
H2O + O2
化脓性球菌的分离鉴定
A群链球菌的防治原则
A群链球菌
主要通过飞沫传播，应对病人和带菌者及时治疗，以减少传染源。另 外，还应对空气、器械和敷料等消毒。对急性咽喉炎和扁桃体的病人， 尤其是儿童，须彻底治疗。以防止急性肾小球炎、风湿热和亚急性细菌 性心内膜炎的发生。首选药物为青霉素G。
葡萄球菌的鉴定
2.生化反应检测
2.1 血浆凝固酶试验
原理：金葡菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维 蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，结合型血浆凝固酶附着于细菌 表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中 的血浆发生凝固；
方法步骤（玻片法）：在在玻片两端各滴生理盐水1d，取肉 汤培养菌液与生理盐水混匀，在其中一端的菌液中滴加兔血浆 1d混匀，观察结果。因致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可 凝固兔血浆，故如血浆中明显小凝块出现，而生理盐水中无此 现象者为阳性，若血浆中无凝块时为阴性。
A群链球菌的鉴定
3.2 吡咯烷酮试验（PYR）检验方法
原理：特异检验A群链球菌氨基肽酶 方法步骤： • 用PYR缓冲液A液浸润PYR测试条末端滤纸； • 用接种环从适合的琼脂培养基上挑取可疑待测菌落，在末端滤纸上
涂抹开或直接蘸取菌落； • 放置于密闭容器；35℃±2℃，孵育5min~10min； • 滴加一滴PYR缓冲液B液至末端涂抹细菌处，观察是否有红色产生。
化脓性炎症是临床上常见病。但是除了 病原性球菌外，其他微生物也可以引起化脓 性感染。
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰液、血 液、脑脊液等。
本次实验以脓汁标本进行病原性球菌的 分离鉴定。
脓汁中病原球菌的查程序
涂片： 革兰氏染色
血琼脂平板 （分离培养）
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医学微生物教研室
2011年6月
精品课件
实验八
脓汁标本中金黄色葡萄球菌的鉴定
精品课件
实验内容
脓汁标本中金黄色葡萄球菌的鉴定
精品课件
目的
熟悉临床标本中常见化脓性细菌的分离鉴定程 序；掌握细菌分离培养的基本技术。
精品课件
实验器材
标本：脓拭子、感染分泌物或模拟脓汁标本 菌种：金黄色葡萄球菌培养物、表皮葡萄球菌 培养基：血琼脂平板、甘露醇发酵管 其他：血浆、生理盐水、革兰染液、玻片、滴管
于玻片玻片左右二侧菌悬液中各加血浆一滴并轻轻摇匀
1~3分钟内观察结果，出现颗粒状凝集为血浆凝固酶试验 阳性，否则为阴性
结果报告：
标本+Leabharlann 浆 白葡菌+血浆阳性（+）/阴性（─）
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检查方法和结果报告
甘露醇发酵试验：无菌操作取标本和白葡菌（阴性对 照）培养物分别接种于甘露醇发酵管，其上覆盖无菌 液体石蜡油，37℃培养18~24小时，观察结果。金 葡菌发酵甘露醇产酸，使培养基变混充，颜色由紫色 变黄色，是为甘露醇发酵试验阳性，而白葡菌相反。
直接显微镜检查：取标本直接涂片，均匀涂成菌 膜，自然干燥，固定后革兰染色，油镜观察。
金黄色 葡萄球菌
革兰染色镜检
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形态
排列 染色性
注：若染色后未发现细菌，可报告“直接镜检未发现细菌”
精品课件
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检查方法和结果报告
细菌分离培养：取脓液或创伤分泌物接种于血琼脂平板上 （接种后4℃保存），划线分离，37℃培养18~24h后，观 察菌落特征，取单个菌落进行革兰染色镜检。
标本+甘露醇
阳性（+）/阴性（─）
注：第2天观察记录结果
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白葡菌+甘露醇
实验报告
本次实验的目的要求、器材、检查原则、标本检 测程序 （简要）、结果报告和结论
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培养箱、 酒精灯、接种环等
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检查原则
在脓汁标本中，以化脓性球菌最为常见，本实 验主要检测金黄色葡萄球菌
用药前采集标本 无菌操作
精品课件
标本检测程序
脓汁、脓性分泌物（未知菌液/固体培养物）
直接
涂片 革兰染色 镜检
接种 血琼脂平板
菌落观察
血浆凝固酶试验
甘露醇发酵
精诊品课断件报告
检查方法和结果报告
血平板培养结果观察
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菌落特点 溶血性 菌落颜色 金黄色 葡萄球菌
注：第2天观察记录结果；如培养48~72h后仍然无菌生长， 则报告“无细菌生长”。
精品课件
检查方法和结果报告
血浆凝固酶试验（玻片法）：
用灭菌接种环取标本和白葡菌（阴性对照）培养物少许， 分别与玻片左右二侧的生理盐水制成均匀菌悬