叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定(20210225065216)
实验报告
植物生理学及实验（甲）实验类型：课程
名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶
绿素含量的测定姓名：专业：学号：指导老师：同组学生姓名：
实验日期：实验地点:
二、实验内容和原理一、实验目的和要求装
四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订
六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理
七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。1和b的方法及其计算。a2、熟悉在
未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为
材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：80%勺乙醇或95%十绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应,
形成绿色的可溶性叶绿素2.
盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分幵。-COOCHCO O
Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC o
+C20H390H -COOCOOCH 绿素卟啉环中的Mg+取代反应。Mg2+, Cu2+取代Cu++取代形成褐色的去 镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ )
取代(Zn2+)绿色褐色
、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 4645其 中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。652 可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b 及总量，而和C 最大吸收 光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯 -比尔定律，
*k+C*kOD=Ca*k 与吸光值之间有如下的关系：
OD 二Ca*k+C 2b1 b1a1a2b 时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为
^/L 和b 的80查阅文献得， 叶绿素a 值如下。数k
k
比吸收系数波长/nm
b 叶绿素a
叶绿素
9.27 82.04 663
45.60
645
16.75
、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶
20
将数值代入式子得：OD663=82.04*Ca+9.27*Cb
OD645=16.75*Ca+45.60*Cb
Ca=0.0127 OD663 - 0.00269 OD645 Cb=0.0229 OD645 经整理后，得到式子：- 0.00468 OD663
三、主要仪器设备
天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等
四、操作方法与实验步骤
1、定性分析：
鲜叶5g+950ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。
皂化反应（3ml）:加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H20 1ml分层后
观察
取代反应（1）：加醋酸约2ml，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。
取代反应（2）:鲜叶2-3cm2，力口Ac-AcCu 20ml加热。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液T稀释（470nm OD 0.5-1 ）
反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素（盐）-稀释（663nm
OD
0.5-1 ）
两者在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰
3、叶绿素定量分析：
鲜叶0.1g ,加1.9mlH2O,磨成匀浆，各取0.2ml加80初酮4.8ml,摇匀，
4000转离心3min,上清液在645, 652, 663测定OD计算Chla,Chlb 和
Chl总量的值。
五、实验数据记录和处理.
1、定性分析：
观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。
皂化反应（3ml）:上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。
取代反应（1）:加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色，为铜代叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
图1
2图图一在420nm左右及690nm左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。
图二在450nm以及475nm波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。
3、叶绿素定量分析：
将数值代入式子，计算得：
/nm波长645 652 663
0.175 第一组0.066 0.094 OD 0.172
0.093
0.068
第二组.
平均0.067 0.0935 0.1735
—
Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 0D645=12.7*0.1735-2.69*0.067=2.02 mg/L
Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663=22.9*0.067-4.68*0.1735=0.722 mg/L CT (mg/L) = Ca+ Cb =2.74 mg/L
Chia 含量(mg/g.FW)= (Ca(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2=1.01 mg/g.FW
Chib 含量(mg/g.FW) = (Cb(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2=0.361 mg/g.FW
Chi 总含量(mg/g.FW) = (CT(mg/L)/1000 ) *2/ 0.1 *5/ 0.2=1.37mg/g.FW
六、实验结果与分析
1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深
浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。
2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片中，叶绿素a 的含量大约是叶绿素b的三倍左右。
3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是以下几个原
因造成的：1.研磨的充分程度不同2.所取叶片位置不同，导致叶绿素含
量有所区别
七、讨论、心得
1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光?
叶绿素有基态（G）,第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3）,光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于
激发态和基态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到
E2,而红，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。E1光能量小，只能使其跃
迁到．
2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。．