第五章 克隆基因的表达_PPT幻灯片
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分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
原核表达 PPT课件
融合蛋白的亲和纯化
运载蛋白 ß-半乳糖苷酶 GST MBP 多聚组氨酸 蛋白A 聚精氨酸 FLAG
亲和配基 APTG IPEG 谷胱甘肽 交联直链淀粉 固化Zn2+或Ni2+ IgG S-琼脂糖凝胶 FLAG特异抗体
洗脱方法 硼酸钠 还原性谷胱甘肽 麦芽糖 酸性梯度咪唑 0.5mol/L 乙酸 NaCl梯度 中性EDTA或pH3.0苷氨酸 缓冲液
（4）1200 rpm，离心2min，收集菌体。 （5）弃上清，向沉淀中加入500ml Starting buffer（20mM磷酸缓冲液
（Na2HPO4和NaH2PO4），200mM NaCl，10%甘油，pH 7.0）， 充分悬浮洗涤菌体。
（6）12000 rpm，离心2min，收集菌体。 （7）向沉淀中加入15ml的starting buffer，重悬菌体。 （8）冰浴条件下超声波处理3min，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，
2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体） 外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡 那抗性，多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后
3 带有&噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等） 受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL 驱动的转录，高温不能
ß-半乳糖苷酶的表达很容 易检测，IPTG，诱导
phoA信号肽利于蛋白质向 周质转运
IPTG诱导启动子，有切割 序列
IPTG诱导地东子MBP信号 肽利于蛋白质向周质分泌
T7启动子（IPTG 诱导）有 化学切割，酶切割位点
IPTG诱导启动子，有肠激 酶切割序列
• 融合蛋白里的伴侣蛋白(运载蛋白)高亲和力 的与特定配基结合，使得纯化融合蛋白 ， 一步就可以达到目的
克隆基因的表达
实际的启动子中很少具备与上述序列完全一 致的区域，启动子的这两个区域与上述保 守序列的相似程度越高，该启动子的表达 能力也就越强。
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
克隆基因的表达
第五章克隆基因的表达基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。
典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。
基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。
思考:基因表达与克隆基因表达的异同? 从表达的对象、过程、场所等方面考虑。
第一节影响外源基因表达的因素利用基因工程技术高水平表达各种外源蛋白质，无论在理论研究还是实际应用上都是十分重要的。
因此，如何使外源基因在宿主细胞中高效表达，成为基因工程中的关键问题。
应该指出，现在基因工程所涉及的受体细胞多种多样，从细菌到高等动植物细胞，乃至动、植物个体；而所涉及到的基因也是成千上万，各不相同，这种差别使得对特定基因的表达研究就有其特定的个性。
影响外源基因高效表达的各种因素：1. 外源基因的表达效率①启动子的强弱。
有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一，也可以说，转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤。
因此，选择强的可调控启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
最理想的可调控启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起细胞死亡等问题。
当细胞数目达到一定的密度，通过多种诱导(如温度、药物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。
②核糖体结合位点的有效性。
SD 序列是指原核细胞mRNA 5`端非翻译区同16S rRNA 3` 端的互补序列。
按统计学的原则，一般SD 序列至少含AGGAGG 序列中的4 个碱基。
SD 序列的存在对原核细胞mRNA 翻译起始至关重要。
③SD 序列和起始密码子AUG 的间距。
AUG 是最首选的起始密码子，GUG、UUG、AUU 和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。
另外，SD 序列与起始密码子之间的距离以9±3 为适宜。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
分子克隆ppt课件
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22
重组DNA的筛选与鉴定
重组DNA的筛选与鉴定方法
1 平板筛选（插入失活、蓝白筛选） 2 限制酶切图谱筛选 3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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23
• 平板筛选
是指利用载体的遗传性标记在平板上直接 筛选的方法。具有抗药性标记的载体转化 宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet） 的培养平板上生长；未转化的则不能生长
M13噬菌体
一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长 度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA
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8
λ噬菌体结构
• 它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上 有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把 噬菌体的DNA注入细菌内
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9
cos位点的作用
• cos位点在λ噬菌体侵染周期中起着两种截 然不同的作用
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半 乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落
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28
LOGO
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29
3 要有尽可能多种限制酶的切 割位点，但每一种限制酶又 要最少的切割位点
4
有时还要求载体要能启动外源 基因进行转录及表达，并且尽 可能是高效的表达
载体的特性
5
从安全角度考虑，要求载体不 能随便转移，仅限于在某些实 验室内特殊菌种内才可复制
6 有适合的标记，易于选择
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5
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
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1. 只有一种RNA多聚酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。 2. 以操纵子为单位
数个相关的结构基因与其调控区结合形 成一个表达的协同单位。
3. 转录和翻译偶联、连续进行。
Hale Waihona Puke 5’有意义链3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)
组成： 阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区
长度：
203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。
IPTG =异丙基硫 代-β-D半乳糖
IPTG有毒、昂 贵，不理想。
（3）色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。
trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。
三、原核生物基因表达的调控
1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。 （1） 启动子序列
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致 顺序（consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
第五章 克隆基因的表达
一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程— —中心法则 （central dogma）。
二、克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
一、原核生物基因表达的特点
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
5’ TTGACA 17bp TATAAT 转录起始位点 核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（2）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac
来自大肠杆菌的 乳糖操纵子。
用乳糖或其类似 物IPTG充当诱导 物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。
Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断”
RNA折叠↓
mRNA折叠
C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三 个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。
5. 翻译增强子 Translation enhancer 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞 中的表达效率的特殊序列。
trpR 阻遏蛋白基因；P1 启动子； P2
O 操纵基因； 衰减子
色氨酸操纵子
（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）
没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因 结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。
trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
转录
链 链
阻遏物
邻氨基苯甲 酸合成酶
2. RNA多聚酶
大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录 tRNA，rRNA和mRNA。
（1）结构
全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2 两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一 段转录终止子。
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 SD
mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻
ii）起始密码：
位于SD序列下游。
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体 16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫ShineDalgarno（S-D）序列。
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）
吲哚甘油 硼酸合成酶
色氨酸 合成酶
分支酸 邻氨基 磷酸核糖基 苯甲酸 邻氨基苯甲酸
CDRP 吲哚甘 油-磷酸
色氨酸
有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才 能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成 酶类的转录（称为corepressor）。
trpR P1 O trpE trpD P2
结合 不转录
阻遏物 色氨酸
E.coli中促使转录终止的DNA位置有 一段反向回文顺序，其后紧接一串A， 称为内终止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎 环结构，使转录物与模板之间配对的碱基 数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性 比较差，有利于转录物脱落而不利于转录 延续。
T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
21
6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞 总蛋白的10%-30%以上。
② 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。
trpC trpB trpA
用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、 操纵基因、和部分trpE基因。
P1 O trpE 目的基因
识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。 2. 以操纵子为单位
数个相关的结构基因与其调控区结合形 成一个表达的协同单位。
3. 转录和翻译偶联、连续进行。
Hale Waihona Puke 5’有意义链3’
3’
反意义链
5’
转录
5’
mRNA
3’
翻译
N
蛋白质
C
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点
5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)
转录↓
5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)
组成： 阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区
长度：
203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。
IPTG =异丙基硫 代-β-D半乳糖
IPTG有毒、昂 贵，不理想。
（3）色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。
trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。
三、原核生物基因表达的调控
1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。 （1） 启动子序列
大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致 顺序（consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
consensus sequences
第五章 克隆基因的表达
一、基因表达：
遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程— —中心法则 （central dogma）。
二、克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体 提取蛋白
导入宿主细胞
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
一、原核生物基因表达的特点
① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’
② -10box（Pribnow Box）
5’-TATAAT-3’
5’ TTGACA 17bp TATAAT 转录起始位点 核糖体结合位点
原核启动子共有序列的功能
（2）翻译的起始位点
①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site
③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。
（2） 乳糖启动子lac
来自大肠杆菌的 乳糖操纵子。
用乳糖或其类似 物IPTG充当诱导 物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。
Plac O 目的基因
阻遏物与操纵基因结合
四聚体的 阻遏物
阻遏物与DNA的结合
①乳糖操纵子控制区的结构
“可移动的lac启动子小片断”
RNA折叠↓
mRNA折叠
C
UC
UG G—C
脱落
A—U
C—G
C—G
G—C
C—G
C—G G—C
RNA聚合酶
AA
CCCAC
UUUU—3
DNA
4. 翻译终止密码
大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三 个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。
5. 翻译增强子 Translation enhancer 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞 中的表达效率的特殊序列。
trpR 阻遏蛋白基因；P1 启动子； P2
O 操纵基因； 衰减子
色氨酸操纵子
（P1是主要启动子，P2的作用只有3%。）
没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因 结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。
trpR P1 O trpE trpD P2 trpC trpB trpA
转录
链 链
阻遏物
邻氨基苯甲 酸合成酶
2. RNA多聚酶
大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录 tRNA，rRNA和mRNA。
（1）结构
全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2 两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。
3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一 段转录终止子。
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
内终止子 intrinsic terminator：
1）Shine-Dalgarno（SD） sequence：
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 SD
mRNA 5’—AGGAGGU——AUG——
UCCUCCA 16S rRNA3’
S-D序列距离AUG的距离也影响翻
ii）起始密码：
位于SD序列下游。
AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）
Shine-Dalgarno（S-D）sequence:
含有一个启始密码子和一段同核糖体 16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫ShineDalgarno（S-D）序列。
二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）
吲哚甘油 硼酸合成酶
色氨酸 合成酶
分支酸 邻氨基 磷酸核糖基 苯甲酸 邻氨基苯甲酸
CDRP 吲哚甘 油-磷酸
色氨酸
有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才 能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成 酶类的转录（称为corepressor）。
trpR P1 O trpE trpD P2
结合 不转录
阻遏物 色氨酸
E.coli中促使转录终止的DNA位置有 一段反向回文顺序，其后紧接一串A， 称为内终止子，形成终止信号。
原因：
① 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎 环结构，使转录物与模板之间配对的碱基 数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作
② 多聚A/U
由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性 比较差，有利于转录物脱落而不利于转录 延续。
T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。
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6. 基因工程常用的原核启动子
（1）最佳启动子必须具备的条件
① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞 总蛋白的10%-30%以上。
② 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。
trpC trpB trpA
用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、 操纵基因、和部分trpE基因。
P1 O trpE 目的基因