克隆基因的表达和常见系统的类型

克隆基因的表达和常见系 统的类型
克隆基因的表达： 指的是外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体
导入宿主细胞
提取蛋白
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞：
原核细胞或真核细胞。
一
、 原核生物 大肠杆菌表达系统
常 见
基因表达 系统
芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统
表
达
系
酵母表达系统
统
真核生物 丝状真菌表达系统
（2）SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处 于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的 前提条件。
在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基 处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会 导致翻译起始效率不同程度的降低。
避免前期表达目的产物对菌株生长的影响； 减少细菌蛋白酶对目标基因产物的降解。
诱导型工作的典型例子： 乳糖操纵子模式
乳糖操纵子：乳糖启动子lac，来自大肠杆菌
用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。
乳糖启动子Plac的可控性：
加入乳糖类似物： 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）诱导作用
的 类 型
基因表达 昆虫表达系统
系统
哺乳动物细胞表达系统
植物生物反应器
二、表达体系的组成： 表达载体 受体细胞
表达载体的构成
启动子 终止子 核糖体结合位点（SD序
列） 筛选标记 复制子（质粒拷贝数） 多克隆位点
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
1、启动子
启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合 的DNA序列，位于基因的上游，长度因生物 种类而异，具有如下特征：
周质内含有种类繁多的内毒素。
3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
1）. 细胞质中表达 表达蛋白常以包涵体（inclusion body）
形式存在。 包涵体是存在于细胞质中的一种不溶 性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。
形成原理未知。
2）. 在周质（periplasm）中表达
在这 啊！
周质：格兰氏阴性大肠 杆菌位于内膜和外膜之间 的细胞结构部分。
三、大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； 基因克隆表达系统成熟、完善； 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被FDA批准为安全的基因工程受体生物。
2、大肠杆菌表达外源基因的劣势：
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
（1）SD序列与起始密码子之间的序列对表 达的影响：
Ⅰ、SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU， 翻译效率最高；
Ⅱ、碱基若为CCCC或GGGG的翻译效率则分别 是最高值的50%和25%。
Ⅲ、紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有 影响，对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言， 在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如 果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平 低20。
3、核糖体结合位点（ RBS） （ribosome binding site） 也叫SD序列 ：Shine-Dalgarno sequence 是mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列
✓ 即位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启 动翻译。
序列特异性：具有保守序列筐
位置特性：位于基因的上游或基因内的前端
方性
种属特异性
如常见的启动子：
启动子
PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35区序列 TTGACA
TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
-10区序列 GATACT
TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
蛋白质从细胞质转运到周质的复 杂机理目前不完全清楚。
优点：容易被浓缩和纯化、有利于正 确折叠、被降解的少。
3）. 胞外表达
使在大肠杆菌细胞中表达 的外源蛋白分泌到细胞外的 培养基中。
通常用溶血素（hemolysin）基因构建分 泌性融合蛋白，或与细菌素释放蛋白 （bacteriocin release protein)共表达。
在这
结构，存于细胞质或细胞周质中，
啊！
无正确的空间构象，一般无生物
活性。
、包涵体表达形式的优点： 外源基因表达产物易于分离纯化； 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定； 能表达对宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。
、包涵体型蛋白表达形式的缺点：
§、包涵体用变性溶剂溶解、复性后， 不 一定能恢复生物学活性，回收的蛋白
生物活性差 ； §、复性成本较高。
2）、分泌型异源蛋白的表达
分泌异源蛋白通过运输或分泌方式定位于 细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分 泌的前提条件。
❖启动子从转录模式上分为：
组成型启动子和诱导型启动子
❖表达系统启动子必须具备的条件：
① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞
总蛋白的10%-30%以上。 ② 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。 ③应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。
注意 了！
• 表达系统常选用 诱导型 启动子 原因？
3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只
能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果 都不太理想。
4、外源基因在大肠杆菌中的表达形态
➢表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白 和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形 态：
包涵体型蛋白
融合型蛋白
分泌型蛋白
1）包涵体型蛋白：
蛋白聚集成致密无膜的裸露
色氨酸启动子Ptrp的可控性
2、终止子
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
❖作用：防止转录过头。
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基 因的表达，其原因如下： 转录产物越长，外源基因本身的转录效率下降； 增加工程菌无谓的能量消耗； 影响重组质粒的不稳定性； 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低基因编码产物的翻译效率