影响血凝和血凝抑制试验结果的几个重要因素
禽流感血凝和血凝抑制试验的影响因素分析
与 血 液 中脂 类 含量 过 高有 关 。处理 办法 是 用一 根 洁 净 的玻璃 或 塑 料 棒 将胶 冻 样 的血 清挑 起 ，在管 壁 上挤 压 几下 ，用适 当的转 速 和 时 间离 心 ，即得到 供抗 体检 测 的血清 样 。 １ ． ４ 血清 的保 存 在５ ｄ 内测 定 的血清 样 品可放 置 于４ ℃的冰 箱 中冷藏 。样 品待 检 时 间超 过 １ 周 的 ，需 低 温冰冻 保存 。保 存 的血 清样 品一 定要 作好 标 记 和 封 闭 。有 时冷 冻保 存 的 血清 样 品需 要 多次 检测 ，血 清需 要 反 复 冻 融 ，这 时要 注 意 ，检 测结 果 已不准 确 。笔 者选 择 免 疫抗 体水 平 较 高 的３ Ｏ 份 血清 ，平 均 分成 Ａ、Ｂ、ｃ ３ 组 ，Ａ 组 被检 血 清反 复 冻 融 ，Ｂ 组 检 测抗 原 反 复 冻融 ，Ｃ 组 为 对 照组 。３ 个 试 验组 同时 做血
禽流感血凝和血凝 抑制试验 的影 响因素分析
郭 新 钢
（ 乌鲁木齐经济技术 开发区 （ 头屯河 区 ）畜牧兽医站 ，新疆乌鲁木齐
摘 要 ：在进 行禽 流感 血 凝 和血 凝 抑制 试 验 时 ，要严 格 按 照操 作 规 程 ，考 虑 多方 面 的 因素 ， 地 进 行操 作 ，尽量 消 除 不利 影 响 ，减 少误 差 ，确 保 试验 结 果 的准 确 性 。 关键 词 ：禽 流感 血凝 ；血 凝抑 制 ；试 验
影响禽流感血凝和血凝抑制试验的因素及对策
影响禽流感血凝和血凝抑制试验的因素及对策作者：郑海玲来源：《兽医导刊》 2017年第8期常用试验方法可以用于鉴定流感病毒分离株HA 亚型，也可以对禽血清中是否存在抗原亚型相同的免疫抗体进行检测。
这种方法操作简单、方便、灵敏度高，在基层动物防疫部门得到广泛应用。
但是很多因素会导致HA-HI 试验结果失真，难以取得预期检测效果，下面将对相关影响因素与对策具体探究。
一、处理与保存血清1. 溶血。
很多因素影响下会使溶血形成，比如，注射器清洁不当，容器不干燥或者受到污染；穿刺方法不正确，损伤了组织；长时间的淤血；过快的抽血速度；将血液向容器中注入，未能将针头取下或者过快的注入速度使大量泡沫产生，久而久之会形成溶血；过于剧烈的震荡，这些都需要在操作中格外注意。
可以在采血时应用一次性注射器，让血清在注射器中自然析出，可以降低溶血发生率。
2. 血清分离。
采集完的血液呈45 ～ 60o 角于室温（20 ℃ ～25 ℃）下放置约2 ～ 3h 即可分离出血清，条件允许时可先将采好的血液呈45 ～ 60o 角于4℃冰箱放置约1h，然后用低速离心机离心3 ～ 5min，转速为3000 ～ 5000 转。
3. 胶冻样血清。
在采集血样中，因为血液中存有过多脂肪会出现胶冻样血清，处理这种血清的方法是应用干净的玻璃棒或者塑料棒挑起胶冻样的血清，在管壁上挤压，直到胶冻样消除为止，然后快速离心，这样可以快速获得检测用的血清样。
4. 保存血清。
血清通常在冰箱中冷藏，5℃为适宜温度。
如果检测用的样品需要保存1 周，需要放置冷冻箱中。
保存好的血清一定要做好标记与封闭处理，避免弄混。
有的血清样品需要反复检测，就需要多次冻融，这样将难以确保检测结果准确。
有研究人员将30 份抗体水平较高的血清作为试验样本，分为①组、②组和③组，①组为被检测血清反复冻融，②组为检测抗原，也反复冻融，③组为对照组。
3组均做血凝抑制试验，结果显示：①组抗体水平较对照组低1 个滴度，②组抗体水平较对照组低2 个滴度。
浅析影响血凝和血凝抑制实验的原因
４ 加样
如果短时间内不能检测 ，应放在一 ２ Ｏ ℃ —． ８ Ｏ ｃ 冰箱内保存 ，运送 病毒悬液和红细胞悬液在使用前一定要摇匀 ，以保证每一 血清 时 应将 血 清放 在 盛有 冰 块 的保 温设 备 中运 送 。被 检血 清 应避 孔 中加 入 的浓 度 准确 一致 ，避免 加 入 的浓 度高 低不 一 ，人 为造 成 免反 复 冻融 ，反 复冻 融 的血 清抗 体效 价 会 降低 。 血清 保存 不 当 ， 误 差 。摇晃 红 细胞 悬 液 时力 度不 宜 过大 ，防止 红 细胞 的结 构被 破 腐 败 变质会 严 重影 响试 验结 果 。 坏 ，造 成溶血 。 加液体时 ，避免吸头与反应板孔接触造成污染。尤其是在最 （ １ ）反 应 板 应 选 择 一 次 性 使 用 ９ ６ ￣ Ｌ ｖ 型 板 ，要保 持 板 面及 后加入红细胞悬液 时，孔 内已有稀释液 、血清 、单位抗原等 ，如 凹孔 的 干净 ，板 面应 水平 ，不能 弯 曲 、倾 斜 ，使用 不 合格 的反应 果 吸头 接触 到 孔 内混 合液 ，会造 成 各个 孔 内液 体相 互 污染 ，导致 板 会 严 重影 响结 果 。板 孔 倾斜 的角度 会 影 响红 细胞 的 沉降 速度 ， 试 验 结果 出现 误差 。所 以 ，在 使 用 移液 器 时 ，一定 要保 持 加样 器 角度 过 小 ，红 细胞 沉 降加 快 ，血 凝价 偏 低 ，血 凝抑 制 价偏 高 。角 吸 头与 凝集 板 孔 间 的距 离 ，以保 证 每个 凝集 孑 Ｌ 内液 体 数量 和浓 度
１ 被检样品
种 ，应— ２ ０ ｏ Ｃ 保存 。在进 行抗 原效 价 的测定 时 ，同一种 抗原 最好
１ ． １ 采样 两 瓶 以上 混合 后使 用 ，并做 重复 试 验 ，取 其平 均值 ，减 少误 差 。 （ １ ）随 机 采集 的被 检 样 本要 能够 代 表 整个 鸡 群 。一 般条 件 抗 原 的凝集 价 在外 界 不稳 定 ，冷 藏 保存 或反 复 冻融 时 其 血凝 价降
血凝和血凝抑制试验影响因素分析
血凝和血凝抑制试验影响因素分析张智鹏【摘要】血凝和血凝抑制试验是检验新城疫、禽流感等疫病抗体效价的一种常用方法,该方法具有经济、简便、灵敏、快速等优点,已被许多市、县级动物疫病预防控制机构实验室所采用,但该试验影响因素很多,常常导致试验结果不准确.作者从试剂的配制、器材的选择及操作中容易出现的问题等方面进行分析,从而避免或减少不利因素的影响,提高试验的准确性.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)010【总页数】3页(P224-226)【关键词】血凝;血凝抑制;影响因素;分析【作者】张智鹏【作者单位】汉中市动物疾病预防控制中心,汉中,723000【正文语种】中文【中图分类】S854.4+3某些病毒(如禽流感病毒和新城疫病毒)能凝集禽类的红细胞,这个现象称为病毒的血凝(HA),可以用来检测样品中病毒的有无和含量的多少,这不是一个特异性反应,这种现象可以被特异性抗体所抑制,即血凝抑制试验(HI),具有特异性。
因此,血凝—血凝抑制试验可用于鉴定病毒、诊断病毒性疾病和抗体效价的监测。
1 样品的采集与处理1.1 样品的采集采血时环境温度最好在20～25℃之间,利于血液凝固。
禽类一般在翅静脉采血。
用一次性注射器每只采集大约2.5 mL血液,去掉针头,缓慢注入清洁灭菌的青霉素瓶中或塑料离心管中,平放,使血液面最大限度与空气接触。
放置40 min左右,等血液凝固后包扎、整理,放在冷藏室内过夜。
第2天即可析出清亮的血清,将上层血清倒在塑料离心管中。
血液样品在运输过程中防止剧烈震动,产生溶血,影响结果判定。
也可将全血立即进行2000～3000 r/min离心10 min,倒出上层血清。
离心后的血清个别呈胶冻样,可能是因为血内的脂类成分过高所致(刘奇峰等,2009)。
在试验前用牙签挤压,就可将血清挤出。
1.2 样品的处理1.2.1 样品的储藏一般情况下,在5 d内测定的血清样品,可放置于4℃冰箱中冷藏,待检时间超过1周的样品需冷冻保存。
影响禽流感血凝-血凝抑制试验的主要因素
可用 于禽 流感亚 型抗 体水平 的检 测和 流感 分离 株
Ｈ Ａ亚 型鉴 定 。该试 验 因其 具有 简便 、 快速、 准确、 实用 的特 点 ，在县 级兽 医实验 室被广 泛 应用 于禽 流 感亚 型抗体 水平 的检测 。 但 在试 验过 程 中， 人 为 因素 的影 响很 大 ， 常 常 因为操作 不规 范等 ， 导 致试 验 结果不 准确 ， 甚至 失败 。 现 就试 验过 程 中常见 的
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ － １ ０ － １ ８
影响禽流感血凝 一 血凝抑制试验的主要 因素一钟蕴珠， 等
经 验 交流 ・ ５ １ ・
图２
非 特 异性 凝集 现 象
０ ． ５ ｍ Ｌ的 血 清 中 加 入 ０ ． ０ ２ ５ ｍ Ｌ的鸡 红 细 胞 ， 轻
滴 度 上升 。
１ ． ３ ４个血凝 单位 （ Ｈ ＡＵ ） 抗 原 的配制
２ 非 特 异 性 凝 集 因子
在 进行 鸭 、 鹅 等水 禽 的禽 流感 抗体 检 测 时， 若 使 用鸡 而非相 应 的鸭或 鹅 的红细 胞悬 液 ，则水 禽
血清 中可 能存在 的 ，对 鸡红 细胞 有非特 异 性凝 集
几个 主要 问题 总结 如下 。
０ ． ０ ２ ５ ｍ Ｌ弃之 ；每孔 均加 入 ０ ． ０ ２ ５ ｍ Ｌ １ ％ 鸡红 细 胞悬 液 。振荡 混匀 ， 室温 下静 置约 ４ ０ ｍ ｉ ｎ后观 察 结 果—— 若前 ２孔 完全 凝集 （ 第 ２孔 为完 全凝集
的终 点） ， 则视 为抗 原配 置正确 （ 见图 １ ） 。
影响禽流感血凝及血凝抑制试验结果的因素及操作规范
2021年3月第38卷第3期影响禽流感血凝及血凝抑制试验结果的因素及操作规范高爱萍，刘胜宇（江苏省徐州市畜牧兽医站，江苏徐州221000）禽流感病毒、鸡新城疫病毒均能凝集鸡的红细胞，这种红细胞凝集现象可以被特异性免疫血清抑制，可用于检测禽注射疫苗后抗体应答水平及证实是否曾感染，广泛应用于禽流感等重大动物疫病防控中。
HA-HI 试验经济、方便，结果可靠，作为WHO 采用的全球禽流感监测方法，也被纳入我国高致病性禽流感诊断技术的国家标准。
在实际操作中，多种因素均会影响血凝抑制试验结果，从而导致试验结果不准确。
笔者长期从事实验室检测工作，参考行业相关资料，现将影响HA-HI 试验结果的因素作一分析。
一样品因素正确采集被检禽的新鲜血液，及时分离血清，避免溶血及腐败变质（有些样品凝固后呈胶冻样，影响检测结果，应避免喂食后立即采集），并做好样品标记及采样记录。
血清分离后及时检测或放置在4°C 冰箱保存。
若暂不检测，可冷冻保存（-20°C 以下），血清测定前须恢复至室温，并充分摇匀。
二1%红细胞因素配制1%的红细胞，最好采集至少3只SPF 公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康鸡的血液。
最好采集成年公鸡的血液制作红细胞供体，太小的鸡红细胞稳定性差，会影响检测结果。
在HA-HI 试验过程中，有时用鸡红细胞检测鸭或鹅等血清样品时会出现非特异性凝集现象，因此，在试验过程中尽量选择与检测样品相同来源的非免疫禽的红细胞。
采集好的血液与等体积的阿氏液混合，或加入3.8%柠檬酸钠，肝素作为血液抗凝剂可能对红细胞凝集反应有影响。
采集好的血液尽快送至实验室，用pH 7.20.01mol/L PBS 洗涤3次，每次以1000r/min 离心10分钟后倒掉上清液，尽可能吸去红细胞表层的白细胞，然后再加入20~30体积的pH 7.20.01mol/L PBS ，重新悬浮红细胞。
洗涤后用PBS 配成体积分数为1%的红细胞备用。
血凝试验和血凝抑制试验的影响因素及应对措施
液 、 原 、 清等 ， 抗 血 如果 管嘴 接触 到孔 内混 合 液 ， 会造 成各 个 孔 内液体 相互 污染 。 以在使 用移 液器 时 ， 定要 保持 所 一 加样 器管嘴 与凝集 板孔 间的距离 ， 以保证每 个凝集 孔 内液 体数量 和浓度准确 。
摘 要 ： 绍 了血凝试验 （Ａ 和血 凝抑制试验 （Ｉ 中的常见 问题 ， 介 Ｈ） Ｈ） 主要 包 ： 照孔凝 集； 括 对 全部凝 集； 细胞 全部 下 红 沉； 标准 阳性对照血 清的抗体 效价与原 结果误 差大于 １ 个滴度 ； 泪滴状流 淌 （ 完全血 凝抑制） 细等； 线 结果 出现 慢或 结果 出现快 ， 且整板无凝 集现 象等 。 并 分析 了其影 响 因素 ， 并提 出了应对措 施 。
滴 度 ； ５） 状流淌（ （ 泪滴 完全 血凝抑 制） 细 ；６） 线 （ 结果 出现慢 或结果 出现快 ， 且整板 无凝集 现象 ；７） 并 （ 凝集 板 出现 跳孔 现 象 ； ８凝 集不 明显 ， （） 无法 判定结果 。
（） １在使用 微量 移液器 时 ， 液体 加入量 发生 误差 。 使 在
年公鸡 的血 ， 一般 要求 用非 免 疫公 鸡 ， 如果 用 免疫 公鸡 代 替 ， 应增加洗涤次 数和时 间。 但
ｌ 血凝试验 （Ａ 和 血凝抑制试验 （ 中的常见 问题 Ｈ） …）
血凝试 验（ Ａ） Ｈ 和血凝 抑制 试验（ ） ＨＩ 中的常 见 问题 主
（ ） 集板 不干 净 。 ４凝 目前 ， 验单位 和基 层多 使用一 次 实
而成为我 国各 地动物 防疫监督 机构和养殖场户 进行 流行病 学调查 、 免疫程序制定及 免疫效果监测 等的主要手段之 一。 尽 管此监测方法操作简便 、 快捷 、 准确 和实用 ， 但是在实践 中 由于某些 因素的影响， 导致试 验结果不 准确， 甚至无法判定 。 笔者根据多年的实践操作将实验中的影 响因素浅析如下。
不同因素对禽流感病毒H7亚型血凝——血凝抑制试验的影响
202310263试验研究不同因素对禽流感病毒H7亚型血凝—血凝抑制试验的影响张蕾蕾（珠海市斗门区动物卫生监督所，广东珠海 519000）摘要：本文分别从抗体稀释液、红细胞悬液、孵育温度、抗体作用时间等不同因素分析禽流感病毒H7亚型血凝血凝实验效果的影响，在操作、方法、人为等因素进行规范，从而避免血凝抑制试验的失败和实验准确性，进而提高免疫抗体的监测准确性、可靠性、稳定性，为一线疫病监测特别是流感检测提供可鉴之资。
关键词：血凝抑制实验；禽流感病毒H7亚型；抗体监测；影响因素中图分类号：S858.31 文献标志码：B 文章编号：1003-8655（2023）10-0010-03高致病性禽流感对禽类养殖业的危害性非常大，目前最常用最有效的预防及控制该类疫病发生的主要途径是进行疫苗的免疫，对于经过免疫后家禽的抗体水平的监测结果直接影响着整个群体的免疫效果、疫病防控、养殖厂的经济效益。
血凝和血凝抑制试验被广泛应用于监测禽流感病毒抗体效价、病毒鉴定、监测病毒抗原的变异、流行病原学调查、动物群体疫情的监测等。
本研究主要研究稀释液、红细胞悬液、温度、抗原—血清作用时间、反应板类型，对禽流感病毒H7亚型血凝—血凝抑制试验的影响，为禽流感血凝—血凝抑制试验的进一步研究和应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物材料采集珠海市斗门区家禽批发市场的肉用鸡血样20头份，离心分离血清编号，作为试验用血样；6只非免疫肉鸡。
1.1.2 试剂和仪器96孔微量反应板、加样槽、移液枪、枪头、烧杯、离心管；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氢氧化钠、盐酸均为国产分析纯；H7血凝抑制抗体检测抗原，H7阳性对照血清、阴性对照血清均为哈尔滨维科生物技术有限公司；酸度计，上海仪电；TG16W高速离心机，长沙湘智；恒温培养箱，上海精宏；微量振荡器，江苏新康；小面板磁力搅拌器，德国IKA；超纯水仪，Direct Q5；高压灭菌锅，重庆雅玛拓。
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影响血凝和血凝抑制试验结果的几个重要因素血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验是目前我国对禽类疾病进行流行病学调查、疫病诊断、防疫监测等工作的主要手段。
各大养殖场、兽医门市、动保实验室、兽药疫苗生产厂家均可进行操作。
该试验虽然操作简便，但每疏忽一步都会直接影响最终结果的判定。
本文总结了笔者在工作及学习中所整理的一些最为重要的影响因素。
1.红细胞悬液的影响
差值法配制1%鸡红细胞悬液：采集2-6月龄SPF健康公鸡的血液，与等量阿氏液混合，将血液配平放入离心机中，2000转／分钟离心10分钟。
共离心三次，第一次和第二次离心结束后，将上清液倒掉，第三次离心结束后，不要晃动离心管，用注射器、吸管或移液枪将上清液除去，尽量去除干净。
用1000ul移液枪向离心管中加入5ml生理盐水（或PBS），然后混匀离心管中的液体。
用1000ul移液枪将离心管中的液体移入干净的瓶子中，记下毫升数A。
A与5的差值B就是鸡红细胞的数量，按照1%比例向瓶子中加入相应量的生理盐水（或PBS），配成1%的鸡红细胞悬液。
如果红细胞浓度偏高，则血凝价可能偏低，血凝抑制价可能偏高；如果红细胞浓度偏低，则血凝价可能偏高，血凝抑制价可能偏低。
2.抗原凝集价的测定
血凝试验测抗原凝集价：在微量板上，从第1孔至12孔或所需之倍数孔，用移液器每孔加入PBS（生理盐水）25ul 。
用移液器吸取被测抗原25ul，从第1孔起，依次做2倍系列稀释，至第11个孔弃去移液器内25ul液体。
每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，在最后1列设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟。
当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。
以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。
抗原凝集价的测定直接影响下一步试验中4HAU血凝素配制的准确程度。
3.4HAU血凝素的影响
将配制好的4HAU血凝素用PBS（生理盐水）稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7，在每一稀释度的25ul体系中加入25ul PBS（生理盐水），再加入1%鸡红细胞悬液25ul，摇匀，置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟判定结果。
如果前2孔100%凝集，第三孔50%凝集，说明4HAU血凝素准确。
如果4HAU的血凝素液偏高，则测定的血清抗体效价可能偏低；如果4HAU的血凝素液偏低，则测定的血清抗体效价可能偏高。
4.血凝抑制试验结果判定的影响
试验过程中，建议在微量板的中间划一条竖线以便于读数时能快速识别结果所对应的列数。
当红细胞对照孔中的红细胞流淌到血凝抑制平板底部时，马上读数，只要血清样品中的红细胞流淌的状态没有达到红细胞对照孔的标准，则不予读取。
读数速度要快且只能读取一遍。
5.试验过程中移液器使用的影响
（1）容量设定：
移液器在容量设定时，当我们从大值调整到小值时，刚好就行;但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。
（2）预洗吸头：
在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。
其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在白套筒室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让白套筒室内的气体达到饱和，负压就会自动消失。
（3）吸液：
先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ML、P10ML小于或等于4毫米(浸入过深的话，液压会对吸液的精确度产生一定的影响，当然，具体的浸入深度还应根据盛放液体的容器大小灵活掌握)，平稳松开按钮，切记不能过快。
（4）放液：
放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。
如果这样操作还有残留液体存在的话，就应该考虑更换吸头了。
千里之堤，溃于蚁穴，小小的误差，积少成多便是错误，试验的结果也将截然不同。
所以在血凝及血凝抑制试验中，一定要细致耐心，严格按照SOP进行操作，同时综合考虑各方面因素，发现问题及时纠正处理，这样才会获得满意的、准确的结果，才能为客户提供更加完美的服务！。