实验六多糖的制备与检测

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实验结果与分析
实验记录： 1、实验原料质量：10.085g
实验 pH=6.0 - 6.5
2、提取固液比为：1:6
3、最后一次离心所得液体的体积：V=134ml
4、产品 OD 值测定：
稀释倍数 OD 值
100 0.885
1000 0.120
根据葡萄糖溶液标准曲线：
得到标准曲线方程： y 0.249x 0.003 OD 值为 0.885 时， y 0.249x 0.003 0.249 0.885 0.003 0.2234(mg / ml) OD 值为 0.120 时， y 0.249x 0.003 0.249 0.120 0.003 0.0329(mg / ml) ① 根据稀释 100 被数据计算：
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基本实验方案
实验步骤： 1.灭内源酶活:将大麦磨成粉(40 目),85℃烘 30min。 2.除淀粉:按大麦粉：水等于 1∶6 加入水,90℃糊化 30 min,然后降温至 70℃, 调 pH=4.5 加 2ml 淀粉酶处理 2h。 3 去蛋白质:用胰蛋白酶在 37℃下 pH=7.5 处理上述溶液 2h。(1000ml 去淀 粉液加蛋白酶 0.5m) 4 去酶:在 90℃,水浴 10 min。 5 去纤维素:将上述溶液用 8000min 的离心速度离心 10min,（所得上清液 为含有β-葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单糖、低聚糖、水溶性维生素的溶 液。） 6 浓缩、除杂:由于多糖属大分子物质,而氨基酸、寡肽、单糖、低聚糖等 属小分子物质,用超滤法除去,同时也可用作浓缩。将清液用截留分子量为 10000 的膜,压力 1.2~1.4 MPa,温度 30℃,浓缩。 7 分离纯化:用饱和硫酸铵溶液将多糖沉淀,然后用无水热乙醇洗涤,再离 心收集,丙酮洗涤,真空干燥,得粗产品β-葡聚糖。 8 蒽酮法检测。(方法见第 5 页) 工艺流程图：
试剂 0
100 μg/mL 葡 0
萄糖溶液（ml）
管号
1
2
3
4
5
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蒽酮试剂（ml） 5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
葡萄糖量（μg）
0
20
40
60
80
100
将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮 10 min ，取出冷却，在 620nm 波 长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ） 为横坐标绘制标准曲线。 样品测定 取待测样品提取液 1.0mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色 测定光密度。重复 3 次。
实验六 多糖的制备与检测
实验申请
实验项目：从植物种子中分离制备多糖（主要为β葡聚糖）
实验材料：大麦种子
实验器材：
（1）万能粉碎机
（2）恒温干燥箱
（3）电子天平
（4）恒温水浴锅
（5）集热式恒温加热磁力搅拌器
（6）离心机
（7）分光光度计（配套比色皿）
试剂：淀粉酶、蛋白酶、无水乙醇，Na2CO3，HCl（调 pH 用），蒽酮试剂，
(3)去蛋白质:用胰蛋白酶在 37 ℃下处理上述溶液 2h。(1000ml 去淀粉液加蛋白酶 0.5m)
(4)去酶:在 90℃,水浴 10 min。
(5) 去纤维素: 将上述溶液用 6000min 的离心速度离心 10min,（所得上清液为含有β葡聚多糖、氨基酸或寡肽、单 糖、低聚糖、水溶性维生素的 溶液。）
葡萄糖标准液（ 100 μg/mL ）。
耗材
（3）试管 25ml×8
（4）pH 试纸
（5）烧杯 200ml×5
（6）50ml 容量瓶×5
（7）多种规格移液管
参考文献： [1] 蒋本国，王艳颖，李春斌，刘秋.生物化学实验.大连民族学院.2010.7 [2] 王镜岩，朱圣庚等，生物化学教程，高等教育出版社，2008.6. [3] 谭天伟. 生物分离技术.北京：化学工业出版社.，2007.7 [4] 刘宝全. 生化分离工程实验讲义（内部试用版）.大连民族学院生命科学学 院.2011.6
乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖
类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与
蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长
下进行比色。
实验材料补充
1、 测定多糖含量的其他方法
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生 物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 注意： （1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色 持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数 0.9 校正μg 数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的 校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在 0.1——0.3 之间。比 如：小于 0.1 之下可以考虑取样品时取 2 克，仍取 0.2ml 样品液，如大于 0.3 可 以减半取 0.1ml 的样品液测定。 2、硫酸苯酚法与硫酸蒽酮法测多糖对比： 2.1.苯酚法测定可溶性糖 植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖 的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙 红色化合物，在 10－100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在 485nm 波长 下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。 苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本 不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定 160min 以上。 2.2.蒽酮法测定可溶性糖
乙醇洗涤,再离心收集,丙酮洗 涤,真空干燥,得粗产品β-葡聚糖。
(8)蒽酮法检测。
蒽酮比色法：
葡萄糖标准溶液（ 100 μg/mL ）：准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖， 溶于 蒸馏水并定容至 100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把 浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶 内。称取样品粉末（ 5 ～ 100 mg ），放入大试管中，加入 15 mL 蒸馏水， 在沸水浴中煮沸 20 min ，取出冷却，过滤入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏 水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作 取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入 各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量
生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量
测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖
与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等
（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮
法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
出的多糖为粗提产品，纯度不高，含有大量的杂质。 2、实验所得产品的粗提率为 36.70%。根据文献记载偏高，也说明了所提
物质中有大量杂质，初步分析为一些为除去的淀粉、纤维素、蛋白质、 水溶性维生素等成分。 3、本次试验中添加的淀粉酶用量为严格按照比例添加，会导致淀粉清除不 彻底，影响实验结果。 4、本实验中应注意三次离心的目标产物与离心的目的：
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在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总
量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合
物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞
壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，
不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半
灭内源酶活
除淀粉
去蛋白质
浓缩 除杂
去纤维素
去酶
分离纯化
蒽酮法检测
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实验记录
操作步骤：
(1)灭内源酶活:将大麦磨成粉 (40 目),85℃烘 1 h。
(2)除淀粉:将沉淀按 1∶6 比 例溶于水,90℃处理,糊化 30 min,然后降温至 60℃,pH 值 4.0~4.5 用糖化酶处理 2h。100g 大麦粉糊化后加入 15ml 糖化 酶.
实验原理： 1、大麦是我国古老的药食兼用植物。我国大麦资源丰富,但 70%以上的大 麦和大麦麸皮用作饲料,大麦资源利用附加值低。研究表明,大麦具有调血 脂、抗衰老、降血糖等多种药理活性。多糖作为一种重要的生命物质,具有 多种生物活性。本论文以大麦和大麦麸皮为原料,研究大麦多糖和大麦麸皮 多糖的提取、抗氧化活性和体外抑瘤作用,为功能性食品和药品的研究开发 提供依据,为大麦和大麦麸皮的高效利用提供新途径。在大麦胚乳细胞壁 (75% ) 和糊粉层细胞壁(26% )中含有 3% ~5%的β-葡聚糖,有些品系可高达 12%β- 葡聚糖是一种重要的非淀粉多糖,其结构由均一的 D-吡喃葡萄糖 (Glcp)单位通过β-(1→3)和β-(1→4)键连接而成,其中大约包括 58% ~72% 的由β-(1→3)键连接的纤维三糖和 20% ~34%的纤维四糖单位。β-(1→3) 键往往单个存在,β-(1→4)键则可 2 个、3 个连续存在,最大可以达到 14 个葡萄糖单位[3]。这些结构特点,使得β-葡聚糖表现出可溶性、高黏性、凝 胶形成等多种功能特性,因此β-葡聚糖不仅具有降低胆固醇、降血糖、改善 肠道功能等保健作用[4, 5];而且还可以作为增稠剂、凝胶剂等应用于食品工 业中，是一种重要的可溶性膳食纤维。 2、蒽酮法测定可溶性糖原理 :糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛 或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍