荧光法测定血液中脂质氧化损伤标志物及抗氧化物的研究与临床应用_张秀明

第7卷　第2期河南医学研究Vol .7　No .21998年 6月H ENAN M EDICAL RES EAR CHJune 19981　湖南医科大学第二附属医院　2　河南医科大学第一附属医院荧光法测定血液中脂质氧化损伤标志物及抗氧化物的研究与临床应用张秀明　沈琪琳　王长虹　贾福军　雪松梅　唐爱国1　钱书虹2(新乡医学院第二附属医院　新乡　453002) 摘要　目的:探讨血液中脂质氧化损伤标志物及抗氧化物的检测方法。

方法:对荧光法测定血液过氧化脂质(L PO )、水溶性荧光物质(WSFS )、还原型谷胱甘肽(GSH )、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx )和维生素E (V it E )的实验条件、测定步骤、激发波长和发射波长进行研究,并进行系统的方法学评价。

结果:改进或建立了血液LPO 、WSFS 、GSH 、GSHPx 和V it E 的荧光测定法,并应用于临床。

结论:这些方法简便、快速、准确、灵敏、稳定、经济,适合临床应用。

　关键词　荧光测定法;脂质过氧化物;还原型谷胱甘肽;谷胱甘肽过氧化物酶;维生素E 中图分类号　R445 脂质氧化损伤标志物主要包括过氧化脂质(LPO )和水溶性荧光物质(WSFS );抗氧化物主要包括抗氧化酶如SOD 、CAT 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH Px )等和非酶抗氧化剂如还原型谷胱甘肽(GSH )和Vit E 等。

上述指标检测对多种疾病如心脑血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、各种肝病的诊治或机理研究具有重要意义。

我们从1990年开始,对荧光分光光度法(荧光法)测定脂质氧化损伤标志物和抗氧化物进行了系列研究,改进或建立了血清LPO 、WSFS 、GSH 、GSHPx 和Vit E 的荧光测定法,并探讨了它们在急性脑梗塞、慢性肾炎、急性一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACM P )和精神分裂症等疾病中的应用价值,现报告如下:1　荧光法测定血清LPO 的研究[1]1.1　材料与方法1.1.1　试剂与仪器:试剂为8μmol /L1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP )标准液,20mmol /L 硫代巴比妥酸(TBA )溶液,甲醇,双蒸馏水;仪器为日本产Hitachi 650-60型荧光分光光度计及057型X -Y 记录仪。

1.1.2　测定方法:取三支10ml 带塞试管,分别注明测定管、标准管和空白管,测定管加血清20μl ,标准管加TEP 标准应用液20μl ,空白管加水20μl ,各管依次加水2.0ml 、TBA 溶液1.0ml ,混匀,100℃加热60min ,冷水冷却,各管加甲醇1.0ml ,充分混匀,3000r /min 离心10min ,取上清液以激发波长515nm ,发射波长550nm 测定各管荧光强度(F ),按下式计算出LPO 含量(以MDA 表示):血清LPO 含量(μmol /L )=F 测定管-F 空白管F 标准管-F 空白管×81.2　结果1.2.1　实验条件选择:比较TAB 浓度、加热时间和甲醇用量对荧光强度的影响,以探讨最适反应条件。

结果TAB 浓度为20mmol /L ,加热时间为60min ,甲醇用量为1.0m l 时,荧光强度最大,在此条件下灵敏度最高。

1.2.2　荧光光谱:将血清样本和标准应用液按实验方法操作后分别在荧光光度计上进行激发波长(λex )和荧光波长(λem )自动扫描,结果λex 均为525nm ,λem 均为550nm ,与国外的报导完全一致。

为了排除瑞利散射第2期荧光法测定血液中脂质氧化损伤标志物及抗氧化物的研究与临床应用·165·光的影响,λex 选择515nm 。

1.2.3　方法学评价　TEP 浓度在20μmol /L 以下时标准曲线线性良好(γ=0.9994),本法的最低检测限为0.16μmol /L ,与国外采用HPLC -分光光度法的检测限接近,平均回收率为105.08%,重复性CV =4.23%,葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、蛋白质等均不干扰测定,但标本应避免溶血;荧光强度在2小时内保持稳定,正常参考值为3.97±0.76μmol /L ,与多数文献报道的在5μmol /L 以下相符。

1.3　结论　我们建立的方法不需任何预处理,血清在冰醋酸存在的条件下,直接与TBA 混合,100℃加热60min ,LPO 水解释放的M DA 可充分与TBA 形成荧光缩合物,在反应终止后,用甲醇沉淀蛋白质并减少非特异性干扰,可省去预处理和正丁醇提取或HPLC 分离等环节,使操作过程大为简化,且避免了正丁醇的强烈刺激性气味对人体的不良影响。

实验表明,本法操作简便快速,结果准确,灵敏度高,荧光稳定,干扰因素少,不需特殊试剂,经济方便,可满足科研和临床需要。

2　荧光法测定血清WSFS 的研究[2]2.1　材料与方法2.1.1　试剂与仪器:试剂0.1mg /L 硫酸奎宁溶液,乙醇乙醚混合液,高纯度水或双蒸馏水;仪器同上。

2.1.2　测定方法:血清100μl 加入尖底带塞离心管,快速加入乙醇乙醚混合液5.0ml ,立即置混合器上震荡5min ,以3000r /min 离心10min ,沥尽上清液,在沉淀物中加入高纯度水2.0ml ,轻微振荡,待沉淀物完全溶解后进行荧光强度(F )测定,λex 和λem 分别为350nm 和460nm ,用0.1mg /L 硫酸奎宁溶液的荧光强度定标为100单位(U ),则血清WSFS 含量为:血清WS FS (U )=F (被测样品)F (0.1mol /L 硫酸奎宁)×1002.2　结果2.2.1　激发波长和发射波长的选择:λem =350nm ,λem =460nm 。

2.2.2　WSFS 的荧光强度与血清用量的关系:血清用量在200μl 以下时,WSFS 的荧光强度与血清用量呈直线关系(γ=0.9994)。

当血清用量大于300μl 时,加入醇醚混合液后易形成较大凝块,不易摇开,使结果偏低。

我们选择100μl 血清进行测定。

若WSFS 含量大于40单位,则可取50μl 血清测定,结果乘以2即可。

2.2.3　本法与原法的比较:用本法和原法分别对20份血清样品进行了测定,测定结果经配对比较,二者无显著性差异,表明本法与原法的准确度一致。

2.2.4　重复性试验:批内CV =4.2%,批间CV =5.4%。

2.2.5　LPO 与WSFS 的相关分析:用本法测定正常人和急性脑梗塞患者各30例,结果脑梗塞患者LPO 和WSFS 明显增高,且WS -FS 与LPO 的增高具有良好的相关性,γ=0.6849。

2.3　结论　我们将醇醚混合液的用量作了适当调整,两次提取改为一次,使操作过程大为简化,实验表明,本法操作简便快速,重复性好,测定结果与原法一致,且证明血清WSFS 含量与体内过氧化脂质水平具有良好的正相关,二者联合检测更能准确地反映体内脂质过氧化水平。

3　荧光法测定血浆GSH 的研究[3]3.1　材料与方法3.1.1　试剂与仪器:试剂为0.1%邻苯二甲醛(OPA )溶液,0.1mol /L 磷酸盐缓冲液,甲醛溶液,0.5mg /L GSH 标准应用液,10%三氯醋酸(TCA )溶液,双蒸馏水。

仪器为日本岛津RF -510型荧光分光光度计。

·166·河南医学研究第7卷3.1.2　测定方法:测定管取肝素抗凝血浆0.20ml,加10%TCA溶液0.20ml,摇匀,室温放10min后,4000r/min离心10min;取清亮的上清液0.10ml,加甲醛溶液0.10ml,摇匀放置5min,加0.1mol/L磷酸盐缓冲液3.60ml,摇匀后立即加0.1%OPA溶液0.20ml,摇匀后室温放置40min,用空白管调零,激发波长350nm,发射波长425nm,读取荧光读数。

标准管和空白管,二管除分别用GSH标准应用液和水0.20ml代替血浆外,其余操作同测定管。

按下列公式计算血浆GSH含量:血浆GSH(μmol/L)=F测定管F标准管×0.5×1000÷307.33.2　结果3.2.1　激发波长和发射波长的选择:经荧光波长自动扫描,最大激发波长和发射波长分别为350nm和425nm。

3.2.2　方法学评价:GSH浓度在2.5mg/L 内,线性关系良好,γ=0.9993,回归方程为Y =1.62X+56.78,最低检测限为25μg/L,回收率为96.86%～100.31%,重复性CV= 2.75%,荧光强度在加入OPA后40～60min 保持稳定,正常参考值为15.125±3.383μmol/L,男女性别间无明显差异。

3.3　结论　血清(浆)GSH测定能较好地反应肝功能状态。

目前,测定GSH的方法很多,但用于测定GSH都较困难,这是由于血浆中GSH含量低,一般比色法不灵敏,用酶法测定不但需要特殊的酶制剂,而且操作很费时;用HPLC法测定操作麻烦且仪器较荧光法更加昂贵。

本法灵敏度较高,重复性好,结果准确,操作简单,适用于科研和临床。

4　荧光法测定血清(浆)GSHPx的研究4.1　材料与方法4.1.1　原理:我们参考有关文献建立了血清(浆)GSHPx的荧光测定法,原理如下:2GSH+H2O2GSHPxGSSG+2H2OG SH+OPA※荧光复合物随着反应的进行,GSH不断被消耗,经一段时间酶反应后,中止反应,剩余的GSH 与OPA在一定pH条件下生成较特异的复合物,通过测定其荧光强度即可测得GSHPx 的活性。

4.1.2　试剂与仪器:试剂0.4mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0),10g/L OPA溶液,1.0 mmol/L GSH溶液,0.1mol/L Na2HPO4溶液(pH=8.3),稀甲醛溶液,1.25mol/L H2O2溶液;仪器为日本岛津RF-510型或日立650-60型荧光分光光度计。

4.1.3　测定方法血清(浆)GSHPx测定:取小试管分别标明测定、对照和空白管,测定管中加血清(浆)200μl、1.0mmol/L GSH溶液200μl;对照管中加1.0mmol/L GSH溶液200μl;空白管中加水和pH7.0磷酸盐缓冲液各200μl,各管置37℃水浴预温5min,然后加1.25 mmol/L H2O2溶液100μl,混匀并立即记录反应开始时间,37℃水浴保温5min后,立即加入0.6mol/L TC A溶液500μl,对照管中加入血清(浆)200μl,摇匀放10min后,3000r/min 离心10min,取上清液100μl,加稀甲醛溶液100μl,混匀放3min后,加pH8.3磷酸盐缓冲液3.0ml,10g/L OPA溶液100μl,混匀置暗处室温放40min后,以激发波长350nm,发射波长425nm,用空白管调零,读取荧光读数,按下式计算出血清(浆)GSHPx活力:血清(浆)GSHPx(U/L)=对照管读数-测定管读数对照管读数×0.2÷5×10000.2全血GSHPx测定:耳或指血(或静脉血、肝素抗凝)20μl,加水980μl,即为1∶50溶血液,摇匀,取200μl(含血液4μl)代替血清,按上述操作。