解磷解钾微生物筛选
有机磷农药高效降解微生物的筛选与鉴定_张六六
一株高效解钾菌的筛选、鉴定及培养条件的优化
一株高效解钾菌的筛选、鉴定及培养条件的优化
张雷;邱路凡;刘丽红;赵雪钰;韩春梅
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2024(63)4
【摘要】以黑土水稻田中解钾菌为研究目标,共分离筛选出5株解钾菌,通过其形态特征以及测定菌株解钾能力筛选出1株高效解钾菌株S1。
利用16S rDNA鉴定
S1的种属,并通过单因素试验和正交试验优化该菌株的培养条件。
结果表明,分离筛选得到的5株解钾菌均能有效分解钾长石,菌株S1解钾能力最强,解钾率为57.03%,发酵液中解钾量为3.852 mg/L,为最优解钾菌。
初步鉴定解钾菌S1为伯克霍尔德菌(Burkholderia ambifaria)。
经单因素试验和正交试验优化后的培养组分为碳源1.0%甘露醇、氮源1.0%蛋白胨、无机盐0.5%K_(2)HPO_(4),培养条件为温度30℃、时间48 h、培养基装液量(培养瓶250 mL)80 mL、初始pH 6.5、接种量5.0%。
【总页数】7页(P30-36)
【作者】张雷;邱路凡;刘丽红;赵雪钰;韩春梅
【作者单位】东北石油大学地球科学学院;湖北工业大学;大庆油田第三采油厂工艺研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S154.3
【相关文献】
1.高效解磷解钾菌 NX-11菌株的分离筛选、鉴定及最佳培养条件的确定
2.一株高效解钾菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化
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新疆核桃微生物菌肥菌种组合筛选
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ ｏ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ １ ｍａ ｎ ｕ ｒ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｗａ ｌ ｎ ｕ ｔ ｓ
ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｗａ ｌ ｎ ｕ ｔ ｓ ｇ ｒ ｏ ｗｉ ｎ ｇ ｉ ｎ Ｘｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ． Ｆ ｉ ｒ ｓ ｔ ， ｗｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ ｍ ｔ ｅ ｓ ｔ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ
新 疆 农 业 大 学 学 报
２ ０ １ ６ ， ３ ９ （ ４ ） ： ２ ５ ９ ～２ ６ ５
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｘｉ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
文 章 编 号 ：１ ０ ｏ ７ — ８ ６ １ ４ （ ２ ０ １ ６ ） ０ ４ — ０ ２ ５ ９ — ０ ７
组合 、 Ｐ ～ ６ ＋ｐ ４ ＋ｋ ５组 合 、 ｐ 一 ７ ＋ｐ ７ ＋ｋ ｌ ｌ 组合 ， 最 终 获 得 最 佳 菌 种组 合 ： ｐ 一 ７ ＋ｐ ７ ＋ｋ １ １ 。
植物根际促生菌的筛选与应用
摘要摘要植物根际促生菌可以提高不同植物的种子萌发率，促进植株的生长，增加植物叶面积以及叶绿素含量，对植物的生物量及其根长及根的表面积也有一定程度增加，从而加速植物的生长发育进程，还可以拮抗多种植物病原菌生长，降低植物病发率。
本实验研究主要以筛选出具有较高解磷、解钾、产IAA（吲哚乙酸）、产HCN（氰化氢）、产铁载体、产ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶活性的植物根际促生菌（PGPR）为目的，从植物根际及根际土壤中分离筛选得到具有促生活性的菌株100株，再通过定量测定分析其中22株菌具有解磷活性，11株菌具有解钾活性，9株菌具有产IAA能力，16株菌具有产铁载体能力，1株菌具有产ACC脱氨酶能力。
选取其中促生活性较高的20株菌株，进行生理生化特征测定及16srDNA序列测定。
采用平板水培法初步测定这20种菌的促生效果。
结果显示促生效果最好的是菌株2-2、3-1、5、22-2及30-4。
通过盆栽实验发现与对照组相比加菌的实验组均能提高大麦的生物量，其中具有解磷活性的菌株能提高大麦中的有效磷含量，具有解钾活性的菌株能提高大麦的速效钾含量。
盆栽实验测得菌株30-4促生活性高于其他菌株，对其进行培养基条件优化，通过单因素实验与响应面优化得到其最适培养条件：0.29%牛肉膏，1%酵母浸粉，0.78%MgSO4。
优化后产IAA量为106.11mg/L，比优化前提高23.4%。
关键词：植物根际促生菌；筛选；条件优化；大麦AbstractAbstractPlant growth-promoting rhizobacteria(PGPR)can improve seed germination rate of different plants,promote plant growth,increase leaf area and chlorophyll content of plants, increase plant biomass,root length and root surface area to a certain extent,thus accelerating plant growth process,and can also antagonize the growth of many plant pathogens and reduce the incidence of plant diseases.This experimental study mainly aims to screen plant rhizosphere-promoting bacteria (PGPR)with high phosphate-dissolving,potassium-dissolving,IAA-producing,HCN-producing,iron-producing carrier,and ACC deaminase-producing activity,from plant rhizosphere and100strains of life-promoting strains were isolated and screened from rhizosphere soil.Then,22strains had phosphate-dissolving activity,11strains had potassium-dissolving activity,9strains had IAA-producing ability,and16strains had16 strains.The ability to produce iron carriers,one strain has the ability to produce ACC deaminase.Twenty strains with higher life-promoting properties were selected for physiological and biochemical characteristics determination and16srDNA sequencing.The growth promoting effects of these20strains were initially determined by plate hydroponics.The results showed that the best promoting effects were2-2,3-1,5,22-2,30-4. The pot experiment showed that the experimental group with bacteria increased the barley biomass compared with the control group.The strain with phosphorus-dissolving activity could increase the available phosphorus content of barley,and the strain with potassium-dissolving activity could increase the available potassium content of barley.The results showed that strain30-4promoted the life more than other strains,optimized the medium conditions,and optimized the conditions by single factor experiment and response surface optimization:0.29%beef extract,1%yeast extract,0.78%MgSO4.The IAA output after optimization was106.11mg/L,which was23.4%higher than that before optimization.Keywords:PGPR;screening;condition optimization;barley目录第一章文献综述 (1)1.1植物根际促生菌 (1)1.1.1研究背景 (1)1.1.2植物根际促生菌（PGPR）的含义 (1)1.2PGPR的作用机制 (1)1.2.1解磷作用 (2)1.2.2解钾作用 (2)1.2.3生长素 (2)1.2.4铁载体 (3)1.2.51-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶 (3)1.2.6诱导寄主植物对干旱的忍耐力 (3)1.3PGPR的研究进展 (3)1.4PGPR展望 (5)1.5本实验研究内容 (5)第二章植物根际促生菌的分离筛选及鉴定 (6)2.1实验材料 (6)2.2培养基及试剂 (6)2.2.1培养基 (6)2.2.2试剂 (8)2.3实验仪器 (9)2.4实验方法 (9)2.4.1初步筛选 (9)2.4.2解磷活性测定方法 (10)2.4.3解钾活性测定方法 (10)2.4.4产IAA量测定方法 (10)2.4.5产HCN测定方法 (11)2.4.6铁载体测定方法 (11)2.4.7ACC脱氨酶活性测定 (11)2.4.8菌株生理生化鉴定 (12)2.4.916SrDNA序列测定和菌株鉴定 (14)2.5结果与讨论 (15)2.5.1PGPR促生能力的定性测定 (15)2.5.2解磷菌的筛选及定量分析 (17)2.5.3解钾菌的筛选及定量分析 (17)2.5.4产IAA菌的筛选及定量分析 (18)2.5.5产铁载体菌的筛选及定量分析 (19)2.5.6产ACC脱氨酶菌的筛选 (20)2.5.7各菌株生理生化与16SrDNA鉴定结果 (21)第三章植物根际促生菌促生效果研究 (24)3.1实验材料 (24)3.2培养基及试剂 (24)3.2.1培养基 (24)3.2.2试剂 (25)3.3实验方法 (26)3.3.1PGPR平板水培促生实验 (26)3.3.2盆栽实验 (26)3.4实验结果与讨论 (28)3.4.1大麦水培实验结果 (28)第四章一株产IAA菌的发酵培养基条件优化 (36)4.1培养基及试剂 (36)4.2实验方法 (36)4.2.1培养条件单因素优化 (36)4.2.2响应面优化 (36)4.3结果与讨论 (36)4.3.1发酵培养基条件优化 (36)4.3.2响应面优化分析 (39)第五章结论 (43)参考文献 (44)致谢 (48)第一章文献综述1.1植物根际促生菌1.1.1研究背景合成肥料和农药一直被认为是提高作物产量的重要途径，然而，随着化肥农药施用量的增加，引起的负面影响也日益明显。
一株溶磷解钾菌的分离筛选与鉴定
一株溶磷解钾菌的分离筛选与鉴定随着农业生产的不断发展，土壤中的养分供应问题逐渐凸显出来。
磷和钾是土壤中必不可少的元素，对植物的生长发育具有重要的影响。
由于土壤中无机磷和钾的含量有限，很大一部分呈结合态，无法直接被植物吸收利用，需要通过微生物的参与，转化为植物可利用的形态。
溶磷和解钾微生物是一类能够有效分解土壤中有机磷和结合态钾的微生物，对于提高农作物的吸收利用率具有重要的意义。
分离筛选与鉴定这些菌株可以为农业生产提供一种新的途径，用于改善土壤肥力，并减少化肥的使用。
分离筛选这些溶磷解钾菌的关键是寻找适合生长的培养基。
常用的培养基有PDA、LB 和液体MS等。
从农田土壤中采集土壤样品，并将样品带回实验室进行处理。
将土壤样品稀释后接种在已经准备好的培养基上，将培养皿密封后放置在适当的温度和湿度下培养。
在合适的时间内，从培养皿中观察出现菌落的样品，进行进一步的分析与鉴定。
鉴定这些菌株的关键是通过形态学、生理生化以及分子生物学等多种手段进行分析。
通过形态学的方法，可以观察菌落的形态、色素的产生以及孢子的形态等特征。
然后，通过生理生化的方法，可以测试菌株对不同物质的利用能力，如磷酸盐的水解能力和钾离子的溶解能力。
通过分子生物学的方法，可以利用PCR技术扩增16S rRNA基因，并进行测序分析，以确定溶磷解钾菌的亲缘关系。
通过以上的分离筛选和鉴定工作，可以得到一株具有较好解磷和溶钾能力的菌株。
之后，可以进一步对其进行大规模培养和应用试验，以验证其在农业生产中的作用。
通过利用这些菌株，可以提高土壤肥力，减少农药的使用，改善农作物的产量和品质，为可持续农业的发展做出贡献。
一株高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟草吸收钾磷的影响
一株高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟草吸收钾磷的影响1. 引言1.1 研究背景钾是植物生长发育过程中必需元素之一，对促进烟草的生长和发育具有重要作用。
在土壤中过量的钾对烟草生长也会产生负面影响，导致土壤中的钾磷钠钙比例失衡。
为了提高烟草的产量和质量，寻找一株高效解钾菌，通过调节土壤中的钾磷含量，减轻土壤中过量钾对烟草的影响，成为当前研究的热点和难点。
目前，传统的施肥和化肥利用率较低，对环境造成负面影响，因此开展高效解钾菌的筛选和鉴定研究具有重要意义。
高效解钾菌能够有效降低土壤中的钾盐含量，提高烟草的吸收效率，减少废弃物的排放，对于实现农业的可持续发展具有重要意义。
本研究旨在筛选并鉴定一株高效解钾菌，并探究其对烟草吸收钾磷的影响机制，为烟草生产提供新的解决方案，并为绿色农业的发展提供科学依据。
1.2 研究意义高效解钾菌在农业生产中具有重要的应用意义。
随着农业生产技术的不断发展，对土壤和作物营养的需求也越来越高。
土壤中过多的钾元素会造成土壤钾盐累积，导致作物对其他营养元素的吸收受阻，从而影响作物的生长和产量。
研究和应用高效解钾菌可以有效地降低土壤钾盐累积，提高作物对钾磷等营养元素的吸收利用率，促进作物的生长和产量。
高效解钾菌还可以减少农业对化肥的依赖，降低化肥施用量，减少环境污染，并且可以提高土壤的肥力和保护生态环境。
研究高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟草吸收钾磷的影响具有重要的理论和实践意义。
通过深入探究这一领域，有望为农业生产提供有效的技术支持，推动农业可持续发展。
1.3 研究目的本研究旨在筛选和鉴定一株高效解钾菌，并探究该菌株对烟草吸收钾磷的影响，以期为烟草生产提供新的解决方案。
具体目的包括：1. 筛选出具有高效解钾能力的菌株，比较不同菌株的解钾效果，为选取最具潜力的菌种奠定基础。
2. 鉴定所筛选出的高效解钾菌，确定其分类地位及相关特征，为深入研究提供基础。
3. 分析烟草对钾磷的吸收情况，揭示其吸收规律。
解磷菌筛选方案
一、培养基1、无机磷发酵培养基:葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.5g , MgSO4·H2O 0.3g , NaCI 0.3 g , KCl 0.3 g , FeSO4·7 H2O 0.03 g , MnSO4 H2O 0.03 g，磷矿粉5g，调节pH到7.0--7.2,蒸馏水1 000 mL.磷矿粉与其他药品分开灭菌后混合.2、无机磷固体培养基:无机磷发酵培养基中加人琼脂粉18--20 g，用于斜面保藏及平板培养.3、种子液培养基:无机磷发酵培养基中磷矿粉用0.5 g K2HPO4替代.二、耐低温解磷菌筛选方法1、初筛在0和10℃时各取样品5g，放入250 mL锥形瓶中，加95 mL 无菌水和玻璃珠，150r/min，室温振荡30 min，制备成母液。
采用梯度稀释法，将母液稀释至10-7-10-1倍，并分别用无菌移液枪取0.2 mL 接种于无机磷培养基平板中，涂布均匀，待接种液被培养基吸收后，倒置培养于对应温度的恒温恒湿培养箱中，进行低温培养，周期为5 d.以相同浓度接种液培养的菌落数、菌落直径及其周围出现溶磷圈大小作为判断解磷强弱的指标.筛选得到的耐低温解磷菌，经纯化后斜面保藏.全部操作均在无菌条件下进行.2、低温耐性锻炼将得到的菌株接种于无机磷培养基平板中，在初筛温度下培养24h后，降低1℃进行耐低温驯化，7d为1个驯化周期，每个周期结束后，培养温度再降低1℃.如降低培养温度后解磷菌仍能生长，则进行若干周期的适应性低温驯化，周期数视菌种驯化情况而定，然后进行下一阶段耐低温驯化;如果降低培养温度后菌株不能正常生长，则在原培养温度和降低温度间进行反复驯化，直到筛选出耐低温突变株.3、低温条件下解磷菌解磷能力测定分别将斜面保藏的各目的菌株活化，接种于种子培养基，0--10℃（筛选温度）培养摇床培养，120 r/min振荡48 h.菌株浓度达到108 CFU/ml后备用.设接种和不接种培养基2种处理，每种处理5个平行.接种处理中将各种子液按照5%的接种量接种于发酵培养基，培养条件同上，周期7 d.然后进行ρ（可水溶性磷)，ρ（可微生物量磷)和pH 测定。
钾细菌
钾细菌摘要从供试土壤样品中筛选出几株高效解磷、解钾和自生固氮菌菌株,其中,以菌株Ｐ1、Ｋ1、Ｎ1解磷、解钾和固氮效果最好。
盆栽试验结果显示:与对照相比,高效菌株组合Ｐ1Ｋ1Ｎ1能使番茄和油菜的生物量分别提高65.9%和68.4%。
1.1.3培养基。
①ＬＢ培养基:胰蛋白10.0ｇ,ＮａＣｌ10.0ｇ,酵母粉5.0ｇ,Ｈ2Ｏ1000ｍｌ,ｐＨ值7.2。
②阿须贝培养基:甘露10.0ｇ,ＮａＣｌ0.1ｇ,ＫＨ2ＰＯ40.2ｇ,ＣａＣＯ35.0ｇ,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.2ｇ,ＣａＳＯ40.1ｇ,Ｈ2Ｏ1000ｍｌ,ｐＨ值7.0。
③解钾细菌培养基:甘露醇10.0ｇ,酵母粉0.4ｇ,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.2ｇ,Ｋ2ＨＰＯ40.5ｇ,ＣａＣＯ31.0ｇ,ＭｇＣｌ20.2ｇ,Ｈ2Ｏ1000ｍｌ,ｐＨ值7.2～7.4。
④解磷细菌培养基:葡萄糖10.0ｇ,ＦｅＳＯ40.03ｇ,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.3ｇ,ＮａＣｌ0.3ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ40.5ｇ,ＫＣｌ0.3ｇ,ＭｎＳＯ40.03ｇ,ＣａＨＰＯ4或Ｃａ3(ＰＯ4)28.0ｇ,Ｈ2Ｏ1000ｍｌ,ｐＨ值7.0。
⑤固体发酵培养基:麸皮95.0ｇ,麦糠5.0ｇ,ＣａＣＯ31.0ｇ,ＫＨ2ＰＯ40.5ｇ,Ｋ2ＨＰＯ40.5ｇ,Ｈ2Ｏ120ｍｌ,ｐＨ值7.0。
解磷细菌的分离筛选。
在不含磷的基本培养基中添加一定量难溶性的磷酸盐[ＣａＨＰＯ4或Ｃａ3(ＰＯ4)2]制成固体选择性培养基。
将供试土样作系列梯度稀释后涂平板,根据溶磷圈大小挑取单菌落作为初筛的产物。
在250ｍｌ三角瓶中添加100ｍｌ不含磷的基本培养基,加入磷矿粉0.5ｇ,并接种初筛菌株,28℃180ｒ/ｍｉｎ培养7ｄ,钼锑抗比色法[3]检测发酵液中可溶性磷的含量。
解钾细菌的分离筛选。
挑取在阿须贝培养基和钾细菌选择性培养基上都能生长的产荚膜光滑油滴状菌落,接种在100ｍｌ,含钾长石矿粉0.5ｇ的不含钾基本培养基中,28℃180ｒ/ｍｉｎ培养7ｄ,原子吸收法[3]测发酵液中可溶性钾的含量。
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解磷解钾微生物的筛选与初步鉴定
微生物是土壤肥力的核心，土壤中的微生物不仅数量巨大，而且种类极多。
许多微生物对土壤氮、磷和钾等养分的转化和供给起非常重要的作用。
氮、磷和钾均是作物生长发育必需的大量元素。
根瘤菌可以与豆科植物共生固氮, 在生物固氮中占有重要的地位。
溶磷菌、硅酸盐细菌(又名钾细菌)能够分解土壤中的固定态磷、固定态钾转化为作物可以直接吸收利用的有效磷、有效钾。
因此，高效的解磷、解钾菌株对于提高土壤肥力具有非常重要的作用。
一、实验目的
1、从各类土样中筛选高效的解磷解钾菌株
2、熟悉菌株筛选、分离纯化、鉴定等具体操作流程
二、实验原理
分别配制以磷酸钙、钾长石为唯一磷源或钾源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用磷酸钙、钾长石的菌株才能够生长。
因为磷酸钙、钾长石不能溶解于培养基，故在固体培养基平板上表现为浑浊，若菌株能够利用磷酸钙、钾长石，则在培养基中形成以菌落为中心的透明圈，因此可以通过是否产生透明圈来筛选目的菌株。
分别筛选细菌和真菌。
为筛选到真菌，采用在培养基中加入链霉素方法来抑制细菌生长。
三、材料和方法
1、材料
各处取得的土样；
培养基种类如下（g/l）：
（1）牛肉膏蛋白胨培养基：
（2）解磷菌株筛选培养基：
无机磷固体培养基：葡萄糖l0 g，(NH4)2SO40.5 g，酵母粉0.5 g，
MgSO4·7H2O 0.3 g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)2 2 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2，ll5℃灭菌20 min。
（3）钾长石固体培养基：
蔗糖 5 g，葡萄糖 5 g，(NH4)2SO4 0.5 g，酵母粉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷酸氢二钠2 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，钾长石2 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2，ll5℃灭菌20 min。
2、方法
(1) 筛选：
1、配制0.85%的生理盐水，灭菌备用。
2、取5 g采集的土样溶解到45ml 0.85%的生理盐水中，37度。
摇床摇30 min 左右，定为原液。
制作浓度梯度10-2、10-4稀释度，分别取原液、-2、-4 各100 μl 分别涂布于解磷、解钾筛选及牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28℃倒置培养，牛2天，筛选3天。
观察菌落生长，透明圈产生情况。
牛肉膏蛋白胨培养基菌落计数，计算菌数/g土壤。
（2）菌落挑取与纯化并保存：
用接种环挑取较大透明圈的单菌落至筛选培养基平板，划线分离单菌落。
培养后观察是否为纯菌，菌落形态一致，且验证是否有透明圈后挑取单菌落至解磷或解钾培养基斜面中培养至长好。
若不纯则分别挑取形态不同的菌落分别在筛选平板划线，确定透明圈，重复挑取和纯化步骤。
挑取至斜面培养基中培养后，将斜面4度冰箱保存。
（3）菌株复筛
将有透明圈的解磷、解钾菌株各自从斜面上用接种环挑取一环，小心点种在筛选培养基上，每个平板点四个不同菌落，注意不要相互污染。
28℃倒置培养2~3天观察比较透明圈大小，进行记录。
（4）菌种初步鉴定：牛肉膏蛋白胨培养基。
平板菌落、显微镜菌体形态观察、革兰氏染色、半固体穿刺（运动性）等，查伯杰手册，相关生理生化，定属。