丹参种质资源遗传多样性的AFLP分析_温春秀
26份海州常山种质资源遗传多样性的AFLP分析
江苏农业科学 ２０１８年第 ４６卷第 １１期
谢福春，曾现艳，程 瑶，等．２６份海州常山种质资源遗传多样性的 ＡＦＬＰ分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１１）：１９－２３． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１１．００５
— １９—
２６份海州常山种质资源遗传多样性的 ＡＦＬＰｄａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 根据中国数字植物标本馆、《中国植物志》及其他相关文
献记载确定海州常山标本采集地点，结合标本采样地点的地 理位置和 主 要 气 象 因 子 （年 均 温、日 照 时 数、无 霜 期、降 水 量），对海州常山种源分布进行区域划分，根据种源区划确定 １５个省（区、市），根据每个省（区、市）资源的分布情况，确定 采集地点，共选取 ２６个采集地点（表 １），所选采集地点基本 覆盖了海州常山在国内的分布区域。采集的不同地区的海州 常山种源种植于山东农业大学种质资源圃，本试验采集的幼 嫩叶片均是来自不同地区的海州常山 ３年生萌蘖苗。 １．２ ＤＮＡ提取
丹参种质资源研究进展
究概况进 行综述 。
１ 种类资源
正 品丹 参来 源 于唇 形 科 植 物 丹 参 Ｓ ｌｉ ｌｏｒｉａ ａｖ ｍｉ ｉ ｈｚ ａ ｔｒ
Ｂ ｎｅ ｕ ｇ 的干燥根 及根茎 。随着野生 资源的减少 ，０年 代 中期 ７ 药材丹参 已经供不 应求 ， 目前 发现 鼠尾 草 属 Ｓ ｌ／ ａ ｖａ共 有 ４ ０
出水溶性成 分 差 异不 显 著 ，有 药 理研 究 报 道【 ， 东烟 台 ］山 产 的栽 培和野 生丹参在改 善家兔 心肌缺血性 心电 图异常 、 缩 小心 肌梗塞范 围 、 低血 压 、 高小 鼠耐 缺氧 能 力等 方 面无 降 提 明显差 异。天津 天士力 集 团在 陕西 商洛地 区建立 了 自己 的
资源 的研究进展 。认为在进行 丹参质 量评价 时 ， 水溶性 酚酸类成 分还应 引起更 多的重 视 。在建立 优质 丹参 的规 范 化种植 基地 和新 品种选 育方面 ， 仍有大 量基础研究 亟待开展 。
［ 关键 词 ］ 丹 参 ； 种质资源 ； 进展
［ 中图分类号 ］ ８ ［ Ｒ２２ 文献标 识码 ］ Ａ ［ 文章编 号］１０—３２２０ ）７ ４２０ ０ １ ０ （０２０— ９— ５ ０ ４
维普资讯
第２ ７卷第 ７期
２０ ０ ２年 ７月
中 国 中 药 杂 志
Ｃｈｎ ｏ ｒ ａ ｆＣｈ ｎ ｓ ａ ｅ ｉ ｅ ｉａ ｉ ａＪ ｕ ｎ ｌ ｉｅｅ Ｍ ｔｒａＭ ｄ ｃ ｏ
ＶＤ ２ ＮＯ． Ｊ ７． ７
Ｊｌ ， ０ ２ ｕ ｙ ２ ０
多地 区开展丹参 的引种 栽 培 ， 中四川 中江 、 其 山东 烟 台等 地
方制剂如 复方丹参注 射液 、 复方丹参滴 丸 、 复方丹参胶 囊 、 复 方丹参 片等 ， 临床广泛用 于冠心病 、 绞痛 、 被 心 心肌梗塞 和脑 血管疾病 的治疗 。丹参 还具有抗 菌消炎 、 保肝 、 改善 肾功 能 、
丹参三倍体育性的细胞学分析
丹参三倍体育性的细胞学分析鉴定，再将四倍体丹参与二倍体丹参正、反交（4x♀×2x♂或2x♀×4x♂），结实率都很高，收获种子播种后获得三倍体。
染色体倍性结果显示，丹参染色体基数x为8，二倍体（2n=2x=16）、三倍体（2n=3x=24）、四倍体（2n=4x=32）。
田间观察发现，三倍体丹参地上部分（茎、叶）均比二倍体丹参对照增加1～1.5倍，地下部分（芦头、根）比二倍体丹参增加2倍以上。
进一步分析结果显示，三倍体丹参在侧根数目明显增加，三倍体丹参主要活性成分测定显示，样品中的丹参酮IIA、丹酚酸B、丹参酮I、隐丹参酮等的含量均超过《中国药典》规定的水平。
三倍体（3x）是倍数最低的多倍体，一般是由四倍体（4x）与二倍体（2x）杂交产生的，具有多倍体和杂交种产生的双重优势，在药用植物中具有巨大的生产潜力。
从理论上讲，三倍体高度不育，只能依靠无性繁殖继代。
然而，生产实践中发现大多数三倍体具有部分可育性，其育性机制不清。
本研究以丹参三倍体为材料，通过解剖学、细胞遗传学的方法，分析了育性相关的细胞学特点，为阐明三倍体育性的机制提供实验依据，在丹参远缘杂交和多倍体育种生产实践中具有一定的实用价值。
1 材料与方法1.1 材料丹参三倍体材料由南开大学生命科学学院陈力教授馈赠，植物材料为三倍体组培苗，经炼苗后移栽至天津农学院试验田，常规大田管理，由于是组培苗移栽，在生长季植株陆续开花。
1.2 方法1.2.1 细胞学压片丹参三倍体花蕾生长早期，根据花蕾生长的长短不同进行取材，经卡诺氏固定液固定24 h后转入70%乙醇溶液中，4℃条件下保存备用。
采用常规压片法进行减数分裂染色体压片，选取未成熟的花药（长度在1～3 mm之间），用自来水浸泡、清洗20 min以上，然后用2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的混合酶液（2∶1）在28℃对材料酶解30 min，水洗后用1 mol/L HCl 60℃水解10 min，自來水冲洗3次，浸泡20 min，卡宝品红染色10 min。
丹参的生物学特性研究
丹参的生物学特性研究丹参，作为一种具有悠久药用历史的植物，其在中医药学中具有广泛的应用。
为了更好地了解丹参的生物学特性，本文将从形态特征、生态环境、分布区域、药用价值和研究现状等方面进行阐述，并展望丹参生物学特性研究的未来发展。
1、引言丹参，学名Salvia miltiorrhiza，属于唇形科植物。
丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，广泛应用于治疗冠心病、心绞痛、心梗等疾病。
现代药理学研究表明，丹参还具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。
因此，对丹参生物学特性的研究具有重要的理论和实践意义。
2、形态特征丹参为多年生草本植物，主根粗壮，分枝有时有极狭的翅。
茎直立，四棱形，具槽，密被长硬毛，多分枝。
叶状枝窄长圆形，上部渐尖，下部渐狭，基部具浅齿，两面密被柔毛，绿色或稍带紫色。
总状花序很短，具2-4朵花；花梗很短；花萼钟状，绿色；花冠蓝紫色，檐部微呈二唇形。
浆果熟时红色。
3、生态环境丹参生长于海拔1200-1700米的山沟、溪旁、山坡等生境中，适应性较强。
适宜生长的气候条件为温带和亚热带气候，喜欢凉爽、湿润的环境，耐寒、耐旱、喜肥沃的土壤。
4、分布区域丹参主要分布于我国安徽、山西、陕西和甘肃等地，以及其他亚洲国家和地区。
目前，已经有许多地方开始进行丹参的大规模人工栽培，以满足中药材市场的需求。
5、药用价值丹参具有广泛的药用价值，其根部和地上部分均可入药。
丹参含有多种化学成分，包括黄酮类、酚酸类、二萜类等。
药理研究表明，丹参具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性，对于心血管系统、神经系统、免疫系统等疾病均有良好的治疗作用。
在临床应用方面，丹参常用于治疗冠心病、心绞痛、心梗等疾病，以及慢性肝炎、肝硬化等消化系统疾病。
此外，丹参在美容、保健品等领域也有广泛应用。
6、研究现状近年来，国内外学者对丹参的生物学特性进行了深入研究。
在基因组学方面，通过对丹参基因组的测序和分析，发现了许多与丹参药用功能相关的基因及其作用机制。
丹参种质资源研究进展_郭宝林
%
产地
河南1)(野)
河南2)(栽)
山东3)(野)
山东4)(栽)
四川中江(栽) 四川成都(栽) 上海崇明(栽)
陕西西安(栽) 河北 辽宁 江苏(栽) 安徽 湖北 江西 湖南 浙江 山西浦城
第 27 卷第 7 期 2002 年 7 月
中 国
China Journal of
中药杂志
Chinese Materia
Medica
V
ol .27 , N o .7 July ., 2002
·综述·
丹参种质资源研究进展
郭宝林 , 冯毓秀 , 赵杨景
(中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所 , 北京 100094)
总丹参酮
6 .0[ 9]
3 .0 [ 9]
2 .39 ～
7 .0 [ 9 ,11] 0 .92 ～
2 .6[ 9, 11]
1 .4[ 9] 1 .4[ 9]
3 .6[ 9]
0 .16[ 8] 0 .06[ 8]
丹参酮 ⅡА 0 .42 ～
隐丹参酮 0 .135 ～
丹参素
0 .09 ～ 0 .15[ 11] 0 .09 ～ 0 9]
0 .035 ～ 0 .22[ 9, 11] 0 .046 ～ 0 .20[ 9, 11]
0 .015[ 9] 0 .049[ 9]
0 .06 ～ 0 .158 ,10]
0 .06 [ 10]
0 .18[ 8]
0 .07[ 8]
0 .10[ 8]
0 .04[ 8]
0 .8 [ 10]
0 .06 [ 10]
0 .116 [ 10, 13]
0 .05 ～ 0 .12[ 10] 0 .07 ～ 0 .19[8 , 10] 0 .097 ～ 0 .13[ 8, 13] 0 .04 ～ 0 .15[8 , 10]
丹参种质资源与优良品种选育研究进展
平均每个引物组合产 生 ２ ． １７条多态 性条带 ，显示 了较 高 多 态 性 ，聚 类 分 析 将 供 试 材 料 分 为 两 大 类 ２ ）
［ 金项 目］ 山东省科技 发展计 划项 目“ 基 山东道地药 材资源质量控制科技平 台建设 ” 课
１ １种 内变 异 ． 迄今 报 道 丹 参 种 内有 ２个 变 种 １个 变 型 ，包 括
说 明产 地 、环 境 、年 限对 水溶 蛋 白 的种类 与含 量 均
有 影 响 。郭 宝 林 等 采 用 Ｒ Ｐ Ａ Ｄ技 术 对 ４ ４个 （ ９个
居 群 ）丹 参 样 本 进 行 分 析 ，结 果 显 示 不 同 居 群 内 多态 位 点 比率 为 ５ ． ％ ，样 本 可 聚 为 ６个 主要 分 ５０
样 本 进 行分 析 ，结 果 显 示 当相 似 系 数 为 ０ ４ ． ８左 右 时 ，样 本 可 聚为 ２大类 ，第 １大类 是 白花 丹参 ，第 ２大类 是 栽 培 和野 生 样 本 ，提 示 丹 参 和 白花 丹 参 之
原 变 种 Ｓｍｉｉｒ ｉ ａ ｍｌｏｒｉ 、单 叶 丹 参 ＆ ． ｌｏｒ ｚ ｖｒ ｉｉ ｈ ａ ｔ ｈ ａ ， ｔｒ ｚ
花冠 白色 或 淡 黄 色 、奇 数 羽 状 复 叶 、叶 色 淡 绿 ，为 山东 特产 。三 者根 部形 态 几无 区别 ，均 作药 用 ｊ 。
间亲缘关系较远 。王 冰等 研究 发现 ，２ ７个不 同 地 理 居 群 丹 参 多 态 性 带 比率 为 ９ ． ５ ，Ｎ ｉｓ多 ０ １％ ｅ’ 样 性 指 数 为 ０ ２ １２ ｈ ｎ ｏ ． ６ ，Ｓ ａ ｎ ｎ多 样 性 指 数 ， 为
支组和 ３ 个组外个体 ，遗传差 异的 ８ ． ４ ０ ４ ％存在于 居 群 内 ，８ ２ ％ 来 自于 组 内居 群 间 ，１ ．７ 的 遗 ．９ ２％ １ 传差异来 自于组问 ，说 明丹参居群 内遗传多样性十 分丰 富，地 区 间 居 群 遗 传 分 化 不 均 衡 。郝 岗 平 等 采 用 Ａ Ｌ Ｆ Ｐ技 术 对 山 东 ｌ ５个 不 同 产 地 的丹 参
丹参种质资源的遗传多样性研究
丹参种质资源的遗传多样性研究丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)是我国常用大宗药材,具有广泛的药理作用,药材使用量逐年增加。
随着丹参野生资源的数量逐年减少,栽培面积逐年增大,但是栽培丹参存在严重混杂现象。
目前丹参的种植主要集中于四川的中江、陕西、山东、河南、河北等地。
对各产地丹参种源进行遗传多样性和群体遗传结构分析,明确各产地丹参资源的遗传基础和亲缘关系,可为丹参资源的收集保存、分类鉴定、合理开发利用奠定基础,对解决当前丹参种质资源混杂和指导丹参品种选育具有重要的意义。
本研究以来自山东省内外的9个丹参居群为材料,从形态学、细胞学、分子生物学等方面对其形态性状、开花生物学及繁殖特点进行了鉴定和观测,对供试丹参资源各居群的遗传多样性及亲缘关系进行了分析,对11个丹参分离类型进行了产量和品质性状的评价,从中筛选出适于泰安种植的优良栽培类型。
获得的主要研究结果如下:1.通过对9个居群的丹参种质资源地上部性状分析证明,42个性状中叶柄颜色、叶柄长、叶长、叶宽、叶形指数等叶片性状、花色、花萼颜色、株高、冠幅、分枝数等在丹参种质资源中的多样性较大;其遗传多样性存在于居群内和居群间且两者变异程度相近。
通过各居群的遗传多样性比较发现,泰安地区的丹参居群多样性程度最高,菏泽和四川中江的丹参居群较低,其它居群的多样性指数比较接近;省间材料聚类分析结果表明,河南内乡与河南卢氏丹参居群的亲缘关系最近,山东泰安与其它居群的亲缘关系最远;山东省内潍坊与临沂居群的亲缘关系最近,菏泽与其它居群的距离最远。
42个性状聚类可分成6组,综合为7个主成分,其累积贡献率达70.17%;根据主成分分析的结果与性状间的相关性,选出影响力较大的16个性状,包括花部因子、茎部因子、叶部因子等地上部性状,可较好的代替42个性状用于种质聚类分析。
利用欧式遗传距离进行UPGMA聚类可将90个材料分为6个类群;根据主成分分析结果和各类群特点,提出了丹参的分类标准,该标准对今后丹参种质的评价具有一定的指导意义。
不同种质丹参的药材有效成分比较
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（ !: 河北师范大学，河北 石家庄# "?""!& ；%: 河北省农林科学院药用植物研究中心，河北 石家庄# "?""?! ）
摘要：采用 /DEF 法，测定了不同地区丹参的丹参酮 ! 3 和丹酚酸 G 含量。结果表明：所检 测的 !? 个丹参品种，仅有 ? 个品种的丹参酮 ! 3 含量达到药典规定标准，而丹酚酸 G 含量 普遍高于药典规定标准；丹参酮 !3 与丹酚酸 G 之间没有正比关系，不能仅以一种含量作为 衡量丹参品质优良指标；河南卢氏皱叶丹参及四川中江丹参的品质较好，性状稳定，可推广 种植。 关键词：丹参；丹酚酸 G ；丹参酮 !3 ； /DEF ；含量 中图分类号： 7?&@: ? H C# # # 文献标识码：3
/:&$*)4$ ： O( 0V,-),60 6K0 5(+60+68 (. 6,+8K2+(+0 !3 ,+[ 8,-V2,+(-25 ,52[ G 2+ [2..0*0+6 ,550882(+8 (. 8,-V2, T2-62(**K2Y, ，/DEF T06K([ ],8 )80[: OK0 5(+[262(+8 (. 5K*(T,6(4*,^K ：6,+8K2+(+0 !3 ： %"ZG3U 7G=F!A （ $: & _ !?" +T ） ]26K , T(12-0 ^K,80 (. F/CI/=/%" （ @? ‘ %? ） : OK0 [060562+4 ],V0-0+46K ],8 %@" +T: 8,-V2,T(-25 ,52[ G：%"ZG3U 7G=F!A （ $: & _ !?" +T ）]26K , T(12-0 ^K,80 (. T06K,+(- =,506(+26*2-0=.(*= T25 ,52[=/ % I（C"‘ !"‘ !‘ ?> ） : OK0 [06562+4 ],V0 -0+46K ],8 %A& +T: I+-W ? 5(+60+68 (. 6,+8K2+(+0 ! 3 2+ 6K0 *((68 (. !"#$%" &%#’%())*%+" 5,+ *0,5K 6K0 86,+[,*[ (. 6K0 《 FK2+080 ^K,*T,5(^(02, 》 （ %""? ） : 3-- 6K0 5(+60+68 (. 7,-V2,+(-25 ,52[ G K,V0 *0,5K0[ 6K0 86,+[,*[ (. 6K0 《 FK2+080 ^K,*T,5(^(02, 》 : OK0*0 28 +( -2+0,* *0-,62(+= 8K2^ 106]00+ 6K0 5(+60+6 (. 6,+8K2+(+0! 3 ,+[ 6K0 5(+60+6 (. 7,-V2,+(-25 ,52[ G: OK0 a),-26W (. *((68 (. !"#$%" &%#’%())*%+" 8K()-[ 10 0V,-),60[ 2+ 1(6K (. 6K0 6]( ,8^0568 ；6K0 *((68 (. !"#$%" &%#’%())*%+" .*(T 725K),+ ,+[ /0+,+ K,V0 T(*0 V2*6),- 5(T^(+0+68 6K,+ 6K0 (6K0*8: OK0 6]( .2+0 86*,2+8 5,+ 10 2+6*([)50[: ;%< ="*0&： ,"#$%" &%#’%())*%+" G)+40 ；7,-V2,+(-25 ,52[ G ；O,+8K2+(+0 ! 3 ；/DEF； F(+60+6 丹参（ ,"#$%" &%#’%())*%+" G)+40 ）为唇形科（ #"-%"’".） 鼠尾草属（ 7,-V2, ）植物，又名紫丹参、赤 参、大红袍，是常用中药之一。现代药理研究表明，丹参对心血管系统作用十分明显，已成为治疗冠 ［ !］ 心病最常用的中药之一 。丹参还具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量以及抗肿瘤等作
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收稿日期:2007-05-30基金项目:河北省科技攻关项目(06276409D)作者简介:温春秀(1965-),女,河北藁城人,研究员,主要从事药用植物种质资源收集、品种选育研究通讯作者:谢晓亮(1962-),男,河北清苑人,研究员,主要从事药用植物栽培育种研究。
丹参种质资源遗传多样性的AFLP 分析温春秀,吴志明,田 伟,刘 铭,周巧梅,谢晓亮(河北省农林科学院经济作物所,河北石家庄050051)摘要:对55份不同来源的丹参材料,采用扩增片段长度多态性(AFLP)标记,对丹参种质资源在DNA 水平上进行遗传多样性研究,利用NTSYSpc 2.1软件采用非加权配对算术平均法(UPGMA)方法进行聚类分析和计算遗传距离,构建遗传系统进化树。
筛选得到的6对引物的扩增片段具有丰富的多态性,丹参种质资源存在很大的遗传变异,它们之间的相似系数为0123~0176,聚类分析将丹参种质资源分为4个主要类群。
丹参种质资源存在丰富的遗传多态性,AFLP 聚类分析结果与表型特征不完全一致,可能是基因型和环境共同作用于表型的结果。
关键词:丹参;种质资源;扩增片段长度多态性(AFLP);遗传多样性中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2007)增刊-0122-04AFLP Analysis of Genetic Diversity of Salvia miltiorrhiza BgeWEN Chun -xiu,WU Zh-i ming,TIAN Wei,LIU Ming,Z HO U Qiao -mei,XIE Xiao -liang(Institute of Economic Crop Research,Hebei Academy of Agriculture andForestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)Abstract:Amplified fragment length polymorphism (AFLP)was carried out to analyze genetic variation of 55Salvia miltiorrhiza Bge.collec ted in China,Unweighted pair -group method of with arithmetical avera ges (UPGMA)cluster ana-lysis using NTSYspc 2.1soft was used to construc ted a dendrogram to estimated the genetic distances among the popula -tions.All populations could be uniquely distinguished using 6selec ted primer combinations,similarity coefficients ranged from 0123to 0176among the populations,dendrogram revealed distinct segre gation of all the germplasms into four main groups.There is great genetic diversity within the tested 55collections in Salvia miltiorrhiza B ge,AFLP based phylogeny was not absolutely consistent with the based on morphological c haracters may be due to the interaction effect between genotype and environment.Key words:Salvia miltiorrhiza B ge;Germplasm resourse;AFLP;Genetic diversity 丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科(Labi -atae juss )鼠尾草属多年生草本药用植物,以根入药,具有活血调经、镇静安神、消肿止痛等功效[1]。
近年来的研究发现,丹参在治疗心脑血管、降低/氧化疲劳0和抗病毒等方面均具有重要作用,能有效抑制体外肿瘤细胞的增值,能高效拮抗乙肝病毒核心抗原(HBe Ag),有较好的抗艾滋病毒(HI V)作用[2]。
丹参药材使用量越来越大,种植面积逐年增大,广泛分布于华北、华东、西南、西北等地,但是各地栽培的丹参种质资源混杂,而且不同地区的丹参种质资源药用成分含量差别很大,严重影响着丹参药材质量的稳定性,已经成为丹参规范化栽培(GAP)及优良丹参品种(系)大面积推广的瓶颈。
从分子水平上对全国的丹参种质资源进行遗传多样性分析,揭示这些丹参种质资源的遗传基础,对解决当前丹参种质资源混杂和指导丹参品种选育具有重要的意义。
1 材料和方法1.1 材料材料采自河北省农林科学院药用植物种质资源圃,根据植物形态特征初步确定了55个不同种质类型,其中C1-C5,C13,C16,C17,C25来自河北安国,C29来自河北井陉野生;C6,C10-C12,C14-C15,C26-C28,C40-C42,C45-C47,C49-C54来自山东;C7-C9,华北农学报#2007,22(增刊):122-125C18来自甘肃;C19-C24,C43来自陕西;C30-C33来自河南卢氏,C34-C36,C44为河南灵宝;C37-C39,C48来自河南方城,C55来自四川中江。
AFLP 分子标记试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。
1.2 方法1.2.1 丹参DNA 提取 采用C TAB 法进行丹参植物总DNA 的提取[8]。
1.2.2 AFLP 分析 采用Eco R I/Mse I 酶切组合进行试验,接头、引物序列以及试验方案按照鼎国公司AFLP 试剂盒的技术说明书进行。
总DNA 以Eco R I 和Mse I 双酶切,然后加入Eco R I 和Mse I 接头和T4DNA 连接酶16e 连接过夜,其中所用的Eco R I 接头为:5c -C TC GTA GAC TGC GTA CC -3c ,Mse I 接头为:5c -GAC GAT GAG TCC TGA G -3c 。
酶切连接产物稀释10倍后用于AFLP 预扩增反应模板,预扩增的引物为Eco R I 预扩引物序列:E1:5c -GAC TGC GTA CCA ATTCA -3c ,Mse I 预扩引物序列:5c -GAT GAG TCC TGA GTA AC -3c 。
扩增反应条件:94e 4min;94e 1min,56e 1min,72e 1min;26个循环后,72e 再延伸10min 。
预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增的模板。
选择性扩增引物序列为Eco R I 和Mse I 的核心引物序列加上3个选择性碱基。
采用的引物组合为Eco R I/Mse I 引物组合。
扩增反应条件:第一轮扩增参数:94e 30s,65e 30s,72e 80s;以后每轮循环温度递减017e ,扩增12轮;.接着按下列参数扩增23轮:94e 30min,55e 30s,72e 80s 。
1.2.3 数据处理与分析 将电泳图谱的同一位置上的条带视为一个性状,有条带记为010,无条带记为/00。
数据分析用GeneScan 和GenotyperTM软件分析处理,峰值大于200的50~500bp 之间条带记为有效带。
运用NTSYSpc 2.1软件分析计算Ne-i Li 遗传距离和相似系数,聚类分析采用UPGMA 方法构建系统发育树。
2 结果与分析2.1 引物筛选Eco R I+3/Mse I+3引物组合对5个差异表现大的丹参种质进行了多态性检测,选择扩增片段数较多和多态位点百分比较高的引物组合(表1)。
结果选择的6对引物组合中,不同的引物组合所得到的扩增片段数在54~108条之间,平均为79条带,多态性扩增片段为45~96条带,平均为68条带,多态位点百分比在7411%~9113%之间,平均达到8617%。
可见,AFLP 检测丹参种质资源的遗传多样性效率很高,也表明丹参种质资源的遗传多样性极为丰富(图1)。
2.2 55份丹参种质资源的聚类分析结果依据55份丹参种质AFLP 分析由上述6套引物组合扩增的DNA 条带的统计数据,计算种质间的遗传相似系数而构建了系统树状图(图2)。
从聚类分析证明丹参种质在遗传上表现出多态性极为丰富。
在系统树状图中55份种质明显分为4组,第1组包括的种质最多,共有28个种质,主要包括了河北安国、甘肃、河南、山东和陕西等地的丹参种质,这个类群最多,种质在相似系数为0171时分为18个亚组。
第2组包括3个种质为河北种质C3,C5和山东种质C6,分为2个亚组。
第3组包括10个种质,按照相似系数为0165分为6个亚组,包括河南种质、陕西种质、山东种质和四川中江种质。
第4组有13个种质,主要是山东种质和河南种质,分为6个亚组。
丹参种质资源变异丰富,即使是同一地区的种质也表现极大的遗传变异,它们之间的相似系数仅为0123~0176,说明丹参的人工选择程度很低,且组内的遗传相似系数高于组间的遗传相似系数。
表1 6个筛选引物组合对5份丹参种质材料的扩增多态性和多态率Tab.1 The polymorphism amplified by 6selected primer combinations from 5Danshen germplasm引物组合Pri mer crosses 扩增片段总数Total bands 多态性片段Polymorphic fragment 多态性位点百分率/%PercentE+ACC/M+CAC7-2544583.3E+ACC/CTC7-6726387.5AAG/CAC 4-2856874.1AAG/CTA4-5585391.3AAG/CTG 4-71089688.8ACG/CA T 8-4998787.8总计/平均Total/Average476/79412/6886.7图1 55份丹参种质AFLP 分析图谱(选择性引物E -AAG/M -CAC)Fig.1 Banding patterns of Danshen materials amplified by the selected primer combinationE -AAG/M -CAC3 讨论AFLP 是一种广泛用于种质遗传多态性研究、作物品种的鉴定、基因定位种质鉴定和标记辅助育种增刊温春秀等:丹参种质资源遗传多样性的AF LP 分析123等方面的研究[3-6]。