第二讲菌种保藏
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菌种保藏的方法
复苏方法：
从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即 放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直 到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。 开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的 培养基上进行培养。
菌 种 冻 存 管
四、菌种保藏的注意事项
菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢 菌种保藏所用的基质：碳源 操作过程对细胞结构的损害
各大类 产孢子的微生物 细菌，酵母菌
约1～2年 约1～冻干燥保藏法
各大类
>5~15年
繁而高效
液氮保藏法
超低温（－196℃），有保 护剂
各大类
>15年
繁而高效
菌种保藏机构
Ex：
美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC） 我国：1 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 2 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 3 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 4 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 5 抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 6 兽医微生物菌种保藏管理中心 （CVCC）
步骤
1安瓿管的处理
菌备用。
直径8-10mm，长度不小于100mm，洗净高压灭
2 保护剂
低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。 常用的是脱脂奶和血清。
3 菌悬液制备
最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适 当延长培养时间以获得成熟的孢子。
4 冷冻干燥
5 安瓿管的保藏
4-5℃保藏
半固体穿刺保藏法
方法：适宜半固体→培养→4℃保藏 原理：缺氧、低温 适用：好气性细菌，酵母等 保藏期：6-12个月 步骤： 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养 基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良 好后覆盖2-3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔 绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.
菌种保藏的原理和方法.ppt
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后 再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一 代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮 保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡 获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌 种与分发菌种的高质量标准。
保藏斜面活化斜面来自2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。
保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面
六、菌种保藏机构
菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基 础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使 用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。
▲ I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） ▲ NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom） ▲ NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业 部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）
菌种保藏和复苏-精简版
菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
5菌种保藏的原理和方法ppt课件
氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。
5
（三）固体曲保藏法
适用菌种：产孢子的真菌 该法麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为
产孢子培养基，使菌体产生大量的休眠体（孢 子）后加以保存。 注意：控制适当的水分。 保存期：1-3年
6
（四）沙土管干燥保藏法
原理：低温、寡营养 保藏期：4-5 ℃冰箱 保存期1-2年。 适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产
冻干燥对微生物引起的冻结损伤。 常采用脱脂牛奶或血清。 ③菌悬液制备：与保护剂混合，放在安瓿瓶内； ④冷冻干燥（用低温酒精或干冰（-15 ℃以下）使之速冻，
在低温下用真空泵抽干）
8 保藏期：将安瓿瓶熔封，低温4-5 ℃，保藏5-10年。
（五）真空冷冻干燥保藏法
影响保藏效果的因素: 菌种、菌龄和样品中的含水量。 适用菌种：适用于各种微生物。 特点：保藏期长、变异小、适用范围广，较理想保藏
养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
2
二、菌体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
3
（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定
期移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
几率增加。
4 适用菌种：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等短期保藏
（二）穿刺保藏法
原理：低温、缺氧 保藏期： 4-5℃冰箱 保存期6-12个月 适用菌种：各种好气性细菌 液体石蜡作用：防止培养基失水并隔绝氧气 液体石蜡保藏法 （在斜面菌种上加入灭菌后
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（三）固体曲保藏法
适用菌种：产孢子的真菌 该法麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为
产孢子培养基，使菌体产生大量的休眠体（孢 子）后加以保存。 注意：控制适当的水分。 保存期：1-3年
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（四）沙土管干燥保藏法
原理：低温、寡营养 保藏期：4-5 ℃冰箱 保存期1-2年。 适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产
冻干燥对微生物引起的冻结损伤。 常采用脱脂牛奶或血清。 ③菌悬液制备：与保护剂混合，放在安瓿瓶内； ④冷冻干燥（用低温酒精或干冰（-15 ℃以下）使之速冻，
在低温下用真空泵抽干）
8 保藏期：将安瓿瓶熔封，低温4-5 ℃，保藏5-10年。
（五）真空冷冻干燥保藏法
影响保藏效果的因素: 菌种、菌龄和样品中的含水量。 适用菌种：适用于各种微生物。 特点：保藏期长、变异小、适用范围广，较理想保藏
养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定
期移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
几率增加。
4 适用菌种：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等短期保藏
（二）穿刺保藏法
原理：低温、缺氧 保藏期： 4-5℃冰箱 保存期6-12个月 适用菌种：各种好气性细菌 液体石蜡作用：防止培养基失水并隔绝氧气 液体石蜡保藏法 （在斜面菌种上加入灭菌后
《菌种传代与保藏》课件
通过菌种鉴定和纯化，可以了解菌种的属性和特征，如形态、染色、生化反应等，以确定其分类地位 和用途。这有助于保证实验结果的准确性和可靠性。
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
菌种保藏及活化讲解
可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），
故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
5.悬液保藏法（略） 6.低温保藏法
四、菌种保藏的共同注意点
• 1、严格的无菌操作； • 2、用于保存的微生物在生长前必须处于
它生长良好的状态； • 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同
一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期 稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备 的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一 综合性表解，以便读后有一全面了解。
1、斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面 接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃
的保藏方法，分别有不同的保存时间。）
五、与菌种保藏相关的几个概念
• 1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上， 使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的 营养丰富些。
保藏斜面 → 活化斜面
2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良 的生产性能。 保藏斜面 → 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） →活化斜面
菌种保藏及活化
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的
保存、不退化
二、菌种保藏的原理
DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代 谢不活泼的状态 。
代谢不活泼的状态
休眠态（孢子、芽孢） 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
(3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将 培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。 动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引 起不必要的污染。
故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
5.悬液保藏法（略） 6.低温保藏法
四、菌种保藏的共同注意点
• 1、严格的无菌操作； • 2、用于保存的微生物在生长前必须处于
它生长良好的状态； • 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同
一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期 稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备 的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一 综合性表解，以便读后有一全面了解。
1、斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面 接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃
的保藏方法，分别有不同的保存时间。）
五、与菌种保藏相关的几个概念
• 1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上， 使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的 营养丰富些。
保藏斜面 → 活化斜面
2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良 的生产性能。 保藏斜面 → 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） →活化斜面
菌种保藏及活化
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的
保存、不退化
二、菌种保藏的原理
DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代 谢不活泼的状态 。
代谢不活泼的状态
休眠态（孢子、芽孢） 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
(3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将 培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。 动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引 起不必要的污染。
菌种繁育—菌种保藏(食用菌生产技术课件)
原种和栽培种培养好后，应立即用于扩接栽培种或栽培生产 ，不宜保存过久，时间越长，生活力越差，也越容易感染杂 菌。若因特殊情况不能及时使用，原种瓶口用牛皮纸包好， 置4～14℃条件下可保藏一年左右。栽培种短期保存也可放 于阴凉、干燥通风的室内，但种瓶不宜堆叠过高，以免堆内 发热，加速菌丝老化。
（三）沙土管保藏法 可保藏孢子
（四）原种培养基试管菌种保存法
按原种的培养基配制装入大号试管，容量为管高的三分之二，擦净管口塞紧棉 塞，用牛皮纸包扎管口后高压灭菌，然后移入母种，在25～28℃下培养，待 长满菌丝后，立即移到低温干燥环境保存、或埋于尿素、硝酸铵或地洞中保存 ，效果更好，并能延长保存时间。
（五）冷冻干燥保藏法
这种方法采用真空、干燥、低温等 手段，使菌种新陈代谢活动处于相 对静止状态，在低温下快速冷冻， 又在低温下真空干燥，从而使食用 菌细胞的结构与成分保持原来状态 而保存菌种。
还有液氮超低温保藏法、滤纸片保 存法、菌丝球生理盐水保藏法、麦 粒保藏法、干孢子真空保藏法等。 这里不一一介绍。要根据自己的工 作需要及具体条件而定，一边保存 ，一边还要分离，复壮，做好选育 工作，延续菌种的忧良性能。
（二）矿油保藏法
矿油处理
灭菌：152kpa、30min 去水：40~50℃烘至无色透明
无菌检验 ？ 注入种管 口堵胶塞
淹没斜面约1cm 用时再转管
食用菌的菌丝体都可用此法保存 ，操作简单。直立存放于室内干 燥处或低温下保存，一般可保存 一年以上。
使用液体石蜡菌种时，只要用接 种针从斜面上挑取少许菌体，放 在新鲜的培养基上；经过培养， 即可应用，原种则重新蜡封，继 续保存。
菌种保藏
目录
一、保藏的目的原理 二、常用的保藏方法
常见微生物的菌种保藏及原理ppt课件
要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃温 水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用 的同一种培养基斜面上进行培养.从液氮罐中取出安瓿瓶时速度 要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量.并 且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
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（二）诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基 因突变，从而获得高生产能力的菌种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。
{ 物理：紫外线，快中子
诱变剂的种类 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
1.诱变育种的主要环节 （1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液
——诱变 （2）用合适的方法淘汰负效应变异株，
选出性能优良的正变异株——筛选
青霉
桔青霉
3. 根霉属（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis）
4. 红曲霉属（Monascus）
（四）酵母（yeast）
1. 酵母属（Saccharomyces） 2. 啤酒酵母（Saccharomyces
cerevisiae） 2.假丝酵母属（Candida）
产朊假丝酵母（Candida utilis） 3.毕赤酵母属（Pichia）
（五）其它微生物
1.担子菌（basidiomycetes）即菇 类（mushroom） 2. 藻类（alga）
几 种 菌 落
（六）噬菌体（phage）
危害以细菌和放线菌为 生产菌株的发酵工业。
二、微生物发酵工业对菌种的要求
第一节 菌种选育
一、发酵工业常见微生物
（一）细菌（bacteria）
醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 芽孢杆菌属（Bacillus） 短杆菌属（Brevibacterium） 棒杆菌属（Corynebacterium）
（二）放线菌（actinomyces） 最大的经济价值在于产生多种抗生素
从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液， 置入准备好的无菌琼脂内。
将三角玻璃棒浸于酒精中
将三角玻璃棒在火焰上燃烧 （须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）
使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于 恒温培养箱中隔天观察菌落源自目，再依照稀释倍数 推算出菌液浓度。
（4） 生产性能的测定 一般采用两步法：
步骤八
重复第六以及第七步骤，由第七步骤的 第二区中划出第三区，如右上图。
步骤九
重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三 区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后 的营养平板，如右上图。
步骤十
在营养平板上贴好标签，标示好接 种日期、操作者姓名、菌种学名以及培 养基名称。
固体培养基的稀释涂抹接种法
需要使用的仪器——震荡机
2.诱变处理的基本方法 1）诱变剂的选择
（1）诱变剂选择的原则： ①根据实际操作方便； ②采用已成功的经验； ③考虑诱变剂的作用机制，选择不同的方法。 如紫外线作用于DNA分子的嘧啶上，而亚
硝酸作用于DNA分子的嘌呤上，二者混合使用 可使突变谱增宽，但需经过多次分离纯化才可获 得稳定的变异株。
（2）诱变剂剂量的选择： 能够提高正变异幅度的诱变剂量,称为诱变剂
步骤二
轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却
步骤三
以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。
步骤四
更换一个新的无菌营养平板
步骤五
将接种针上的细菌划于一个新的营养平板 上。此为第一菌区 。
步骤六
重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法 灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。
步骤七
由第五步骤的第一区中划出第二 区，如右上图。
分离放线菌时加入植物、岩石、有机混合腐 质等的浸出液作为促生因子，也可用营养贫瘠 或含几丁质的琼脂培养基。
分离霉菌用低碳/氮比的培养基，再加入一 定的抗生素；微酸性培养基。也可加入1： 3000的玫瑰红
（3） 纯种分离 ①划线法：简单、快捷。 ②稀释法：菌落单一均匀。
划线分离法：
步骤一
接种针先以火焰灭菌法灭菌
1.生长迅速，目的产物产量高。 2.易控制培养条件，发酵周期较短。 3.抗杂菌和噬菌体的能力强。 4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。
三、工业微生物菌种的选育
（一）自然选育
1. 自然选育的目的： （1）保持菌种优良性状的稳定性 （2）减少变异或降低变异退化的速度 （3）获得优良菌种
2.自然选育的方法 采样、增殖培养、分离培养和筛选。 （1）采样 ①土样（野生性菌株） ②发酵液（生产性菌株）
初筛：以量为主 复筛：以质为主
①初筛： 通过表现形态来淘汰不良菌株
从菌落的大小、生长速度、颜色、孢子形 成等形态特征分析判断，去除可能低产的菌 落，而将高产性菌落分离、筛选出来。使琼 脂平板培养基上的主要菌落占90%以上。
②复筛 经过分离培养，在平板上出现
很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需 菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于 符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜 面纯培养。
复筛的菌种应及时保存，避免过多传代而 造成新的退化。
a.通过目的代谢产物的考察 通过摇瓶培养进行复筛，以进一步考察
菌种的生产能力的稳定性。 b.传代的稳定性试验
随着菌种的逐级扩大，经过多次传代产 量仍保持稳定的菌种才能用于生产。
在传代过程中要保持试验条件的一致性， 以便能正确的反应各代间生产能力的差异。
吸取准备好欲稀释的菌液
吸取充分均匀后的菌液
取含有 9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。 将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。
将 试 管 于 震 荡 机 上 ， 使 菌 液 混 合 均 匀
取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL， 加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。 重复此步骤直至所需要的稀释浓度。
（2）增殖培养 方法： ①控制培养基成分 ②控制培养条件 ③抑制不需要的菌类 一般情况下采来的样品可以直接进行分离培养，
但如果样品种所含菌类的含量不多，而有大量的 杂菌时，可以通过选择性配制培养基（营养成分、 添加抑制剂）、选择一定的培养条件（如培养温 度、培养基的酸碱度）来控制。
分离细菌时可加入制霉菌素或放线菌酮， 抑制真菌生长。G-菌时可加入结晶紫、煌绿、 胆汁。培养基呈微碱性。
链霉菌（Streptomyces） 小单孢菌属（Micromonospora）
蜡样芽孢杆菌 乳酸杆菌
（三）霉菌（mould）
1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黄曲霉（A. flavus）
2.青霉属（Penicillum） 桔青霉（P. citrinum）