菌种的管理和保藏
菌种保藏室管理制度
菌种保藏室管理制度第一章总则第一条为规范菌种保藏室的管理，确保菌种资源的使用和保护，提高菌种的保存质量，特制定本管理制度。
第二条菌种保藏室是指一个专门用于菌种资源的保存、管理和利用的实验室。
第三条本管理制度适用于所有使用菌种保藏室的实验室及工作人员。
第四条菌种保藏室的管理原则是" 管理科学、操作规范、保藏严谨、使用安全”。
第五条所有菌种的管理必须符合《微生物实验室安全操作规程》和相关法律法规的规定。
第二章菌种保藏室的设立第六条菌种保藏室设有专门的实验室，实验室应符合微生物实验室的相关要求。
第七条菌种保藏室应设有专门负责菌种管理的工作人员，负责日常的菌种保藏、更新、记录等工作。
第八条菌种保藏室应设有专门的存储设施，保障菌种的安全保存。
第九条菌种保藏室的设立必须经过相关部门的认可和注册。
第三章菌种的采集、保藏及更新第十条采集新的菌种来源必须符合相关规定，取得相关部门的许可。
第十一条采集的菌种必须在规定的时间内用适当的方法保存，保证菌种的纯净性和活力。
第十二条菌种的保藏要有完善的记录，包括菌种来源、采集时间、保存方法等。
第十三条菌种的更新要进行定期检查，确保菌种的活力和纯度。
第十四条菌种的更新要在菌种信息系统中记录，保证信息的完整性。
第四章菌种的使用与管理第十五条使用菌种前必须经过专门人员的审批，确保使用目的明确，操作规范。
第十六条使用菌种时必须遵守相关的操作规程，保证操作的安全性。
第十七条使用菌种后必须按照规定的处理方法进行处理，确保操作的安全性。
第十八条菌种使用后必须及时进行记录，保持菌种的流转记录清晰。
第十九条菌种使用完毕后必须按照规定的处理方法进行处理，确保操作的安全性。
第五章菌种保藏室的安全管理第二十条菌种保藏室应设置专门的安全管理人员，协调安全管理工作。
第二十一条菌种保藏室必须建立健全的安全管理制度，确保菌种的安全保存。
第二十二条菌种保藏室必须进行定期的安全检查，发现问题及时整改。
菌种保藏方法
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
菌种保藏管理制度
菌种保藏管理制度第一章总则第一条为规范和加强菌种保藏管理，提高菌种资源的利用率和保藏质量，制定本制度。
第二条本制度适用于菌种保藏单位的管理和操作。
第三条菌种保藏管理应遵循法律法规、国家标准和相关管理制度，保障菌种资源的合法、安全、有效性。
第四条菌种保藏管理应遵循科学性、规范性和合理性原则。
第二章菌种保藏管理制度要求第五条菌种保藏单位应有合格的菌种保藏人员，具有相关专业知识和操作技能。
第六条菌种保藏单位应具备完善的菌种保藏设施和设备，满足菌种的质量保护和管理需求。
第七条菌种保藏单位应制定菌种保藏管理规章制度，明确菌种资源的申请、保藏、使用和监管流程。
第八条菌种保藏单位应建立菌种信息数据库，对菌种资源进行准确、完整地记录和管理。
第九条菌种保藏单位应定期组织对菌种资源进行检测和鉴定，确保菌种的纯度和活力。
第十条菌种保藏单位应加强安全管理，确保菌种资源的安全使用和保护。
第十一条菌种保藏单位应建立菌种资源的追溯机制，对菌种资源的来源和去向进行记录和跟踪。
第三章菌种保藏管理流程第十二条菌种保藏单位应依法收集菌种资源，并进行鉴定和分类。
第十三条菌种保藏单位应按照规定对菌种资源进行保存和保藏，确保其质量和活力。
第十四条菌种保藏单位应制定菌种资源的使用管理规定，明确使用范围和条件。
第十五条菌种保藏单位应建立菌种资源的定期更新机制，确保菌种资源的新鲜和多样性。
第十六条菌种保藏单位应建立菌种资源的信息共享平台，促进菌种资源的交流和共享。
第四章菌种保藏管理监督第十七条有关行政部门应加强对菌种保藏单位的监督和检查，确保菌种资源管理的合法性和合规性。
第十八条菌种保藏单位应定期对菌种资源进行抽查和自检，发现问题及时整改。
第十九条菌种保藏单位应接受社会监督，加强与公众的沟通和交流。
第二十条对违反菌种保藏管理制度的单位和个人，依法给予相应的处罚和通报。
第五章附则第二十一条本制度自颁布之日起正式执行。
第二十二条本制度的解释权归菌种保藏管理部门所有。
菌种的管理和保藏
整理课件
液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
保存条件 -80℃可保存数年.
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菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
整理课件
基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
信息。
整理课件
2015版-指导原则
菌种的鉴定
纯菌的分离 微生物的表型 表型微生物鉴定 通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生 物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不 能完整表达其表型属性。 基因型微生物鉴定
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菌种的鉴定
微生物分类中使用的表型特征
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菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖， 因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
整理课件
菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用 作
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
整理课件
菌液制备用稀释液—2015修定内容
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
整理课件
菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使 用。
生产菌种的扩大培养与保藏简介
生产菌种的扩大培养与保藏简介1. 引言生产菌种的扩大培养与保藏是微生物工程中不可或缺的重要环节。
在微生物工业中，菌种数量的扩大和保藏对于生产规模的控制和后续的实验操作至关重要。
本文将介绍生产菌种的扩大培养和保藏的基本原理、方法和注意事项。
2. 菌种的扩大培养菌种的扩大培养是将初始的菌株培养至足够数量供生产使用的过程。
以下是菌种的扩大培养的基本步骤：2.1 选择培养基根据菌株的特性和要求，选择适当的培养基进行扩大培养。
常见的培养基包括富含营养物的培养基和特殊功能的培养基。
2.2 菌种的预培养在扩大培养前，先进行菌种的预培养。
从保存的菌种中挑取适量的菌落或菌点接种到预培养培养基中，进行为期数小时的预培养。
2.3 液体扩大培养将预培养的菌种转移到液体培养基中，并进行液体扩大培养。
根据需要的菌种数量，选择适当的容器和培养条件进行扩大培养。
2.4 固体扩大培养液体培养经过一定周期后，可以将菌种转移到固体培养基中进行固体扩大培养。
固体培养可以有助于菌落的生长和分离。
2.5 菌种的检测和纯化在扩大培养结束后，需要对菌种进行检测和纯化。
常用的方法包括菌落PCR、生化测试和纯化子代的分离。
3. 菌种的保藏菌种的保藏是为了长期保存和储备菌种，保证其稳定性的一系列措施。
以下是常见的菌种保藏方法：3.1 冷冻保存法将菌种在适当的保存液中制备冻存物，并存放在低温冰箱或液氮罐中。
常用的保存液包括甘露醇、甘油等。
3.2 干燥保存法将菌种在无菌条件下培养至晚期生长期，用无菌纱布吸干培养基上的菌落，将菌落贴附在无菌纸上，然后将纸张放置在干燥剂中保存。
3.3 冷冻干燥法通过冷冻和干燥的交替操作，将菌种制备为干燥粉末，再用密封容器保存。
冷冻干燥法在菌种保存期间能保持菌种的高度稳定。
3.4 液氮冷冻保存法将菌种悬浮液或培养物直接置于液氮罐中，利用极低温度保存菌种。
这种方法能够保留菌种的生物学特性，并保证菌种长期保存。
4. 注意事项在进行生产菌种的扩大培养和保藏时，需要注意以下事项：•严格遵守无菌操作规范，防止污染和交叉感染。
5菌种的管理和保藏
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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可 以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、 干燥和真空是菌种保藏的重要手段。 标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可 将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分 装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存， 超低温冷冻(低于-70℃)等方法保存。
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⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法
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定期检查
主要检查项目 菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形
态、生化特性及血清学检查。
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菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过 程验室主要采用分离纯化的方法。
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⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体。 ⑶选择最适宜的方法保藏。 ⑷定期对保藏的菌种进行检查。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代， （从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止 过度的传代造成菌种变异。
1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任 何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要 时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。
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菌种的来源
药品微生物检验用的试验菌应来自认 可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株， 或使用与标准菌株所有相关特性等效的商 业派生菌株。
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菌种保藏的中心任务
⒈广泛收集各种有用的微生物菌种。 ⒉选择最适宜的保藏方法。 ⒊研究、检验、交换和使用。
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菌种保藏与管理
菌种保藏与管理第一节概述一、菌种的定义菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，也是与微生物有关的生产部门的重要生产资料。
本文所指的菌种，包括可以培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌、病毒、细胞等代表株。
二、菌种保藏的意义微生物具有生命活力，其世代时间（generation time）一般很短，在传代过程中易发生变异甚至死亡。
因此，菌种保藏是一项重要的基础工作，是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
它既是保护微生物资源的一种手段，又为持久而有效的利用微生物资源提供了保证，受到世界各国的极大重视。
很多国家相继建立了专门的菌种保藏机构，组织科学技术人员从事收集国内外长期利用及新发现的各类菌(毒)种。
实行集中保藏、科学的育种传代以及分类管理，并负责同世界各地相互交流，研究保藏菌(毒)种的科技情报工作，使各类菌种长期满足社会需要，更好的为生产和人类健康服务。
三、菌种保藏的目的和任务菌种保藏是应用及研究微生物工作者的一个必须且重要的一门应用学科技术，不单纯是菌种的分离培养、种株纯化、分类鉴别及储藏保管，还涉及多种学科，如微生物生理学、生物化学、生态学、遗传学、形态学、分子生物学以及微生物种群的分类等。
只有掌握了相关学科的科学技术，才有可能全面做好菌种保藏工作。
菌种保藏的中心任务是将现有菌种或广泛收集的各种有用的微生物菌种，选择最适宜的保藏方法，避免在保藏期间和传代过程中死亡、变异及衰退，以保持菌种原有的各种生物学特性，从而达到保证研究、检验、交换和使用的目的。
如何保持菌种性状的稳定是菌种保藏研究的重要课题。
事实上没有哪一种保藏方法能使菌种的原有性状保持绝对不变，所以菌种保藏研究就是要研究各类菌种最合适的保藏方法，使菌种变异和死亡达到最低限度。
因此，菌种保藏研究不但需要研究原种的营养代谢、生理功能和遗传变异，还需研究菌种衰退后仍可恢复其原来的生物学性状和生理功能的科学方法。
菌种保藏也是食品、药品微生物检验工作中的一项常用技术。
微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、前言微生物菌种的保藏是微生物研究中非常重要的一环，它对于保障菌种的长期保存和研究使用具有重要的意义。
本技术规程旨在规范微生物菌种的常规保藏技术，确保其安全、稳定和可持续使用。
二、常规保藏技术1. 冻干法（Lyophilization）：将培养的微生物菌株悬液在前冷冻过程中给予低温、高真空条件，使其中的水分直接从冰态升华为气态，从而避免了常规冻存法中由于结冰时水晶体的生成对菌体的危害，从而达到保存微生物菌株的目的。
操作步骤：a. 微生物培养物经适当稀释后应当倒入试管中，滴入约1ml 20%乳糖溶液在表面形成一层薄膜，待乳糖凝固后，在加入4ml 0.5-0.7%匀浆的2%干燥乳铁粉液，将试管摇匀，再灌入16ml混合液保持无气泡，放置于冰浴上。
b. 待培养物温度达到0摄氏度，再清洗喷雾器，灌入76％露醇20ml，培养物放入冷板上，适当时间后将试管封口放入冷板上经杀菌后真空泵连接，把真空泵打开，通过真空泵提供的条件慢慢降低压强，一般12小时后真空泵关闭。
c. 提供适当温度下作干燥处理，通常使用倍耐安减压干燥器空干40-80小时，干燥后的干燥灸试管，将试管放入吸气瓶中后置入-40—-50摄氏度低温冷冻管内低温保存(一般保存温度为—40摄氏度或更低)，备用空干矿温度—20摄氏度或更低。
2. 酶解冻存法（Enzymatic freezing）：在培养基中添加蔗糖，结合酶解冻存方法，经冻干后的菌种耐冻性和储存时间明显提高。
操作步骤：a. 将微生物分别接种于琼脂平板上，预培养24小时，取2-3份储备品。
菌液于冻干菊花瓶中进行前冷冻，真空抽气消耗20分钟。
b. 平均地用EP管管接受，采用3次“起冻—冷冻”的方法完全冻干，最后0.1至0.3ml真菌液在5摄氏下冷冻6小时，然后在5摄氏下还原18小时。
c. 移除冻存，延长试验保存时间。
必须在-80摄氏下保存。
3. 液氮冻存法（Liquid nitrogen freezing）：液氮冷冻法是现在应用最广泛的冷冻保存方法，在液氮的作用下，微生物菌种在-196摄氏度下冷冻，保持良好的生物活性。
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菌种的鉴定与复壮
菌种的复壮 采用分离纯化的方法。
- 形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一 系列试验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致。
菌种的鉴定
微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性有关。 微生物鉴定需通过已建立的标准微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配 来完成。否则将得不到鉴定的结果. 明确鉴定系统局限性和需要的鉴定水平(属、种、型)。
菌株
枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
培养基
培养温度(℃)
胰酪大豆胨琼脂
30～35
或胰酪大豆胨肉汤。
沙氏葡萄糖琼脂或沙 20～25 氏
沙氏葡萄糖琼脂或马
铃薯葡萄糖琼 脂葡萄糖肉汤
20～25
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
菌液制备用稀释液—2015修定内容
广泛
5～10年以上 复杂、需要专门设备和方法，有效
干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无营养
产孢微生物
பைடு நூலகம்
1～10年
较简便，需制备沙土管，有效
液体石蜡保藏法
低温、缺氧
广泛
1年以上
简便
琼脂斜面低温保藏法
低温 4℃
广泛
短时间
简便
液体冷 冻保藏 法
液体培养基 一定比例甘油
瓷珠冷冻保藏法
低温 低温、缺氧 低温
广泛 广泛 广泛
↓ 斜面培养基 划线传代（4代） → 使用→ 分装冷冻保存
↓ 斜面培养基 划线传代（5代） → 使用→ 分装冷冻保存
。
菌液的制备和使用
斜面培养物1 ～ 3环 ↓
适宜液体培养基5～10ml，培养18～24h 取适 当量，用灭菌生理盐水稀释后比浊（或预实验）
↓ 按比浊结果或预实验将菌液稀释到相应倍数
↓ 平板计数(取上述稀释液1ml加入平皿中加入
菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁 殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作 工作菌株。
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用 。 稳定的黑曲孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。
菌种的鉴定与复壮
菌种的衰退 由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 控制菌种的衰退方法 - 控制传代次数 降低突变几率，采用良好的传代保藏方法。 - 创造适宜的培养条件： - 用不同类型的细胞进行传代 - 采用有效的保藏方法
协调案 ATCC NCIMB
NBRC CIP
美国标准菌种收藏中心 英国食品工业与海洋菌种保藏中心
日本技术评价研究所生物资源中心 法国巴斯德研究所菌种保藏中心
菌种保藏的中心任务
- 广泛收集。 - 选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学特性。
常用菌种的保藏
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢 强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。
半年以上 数十年以上
1年以上
简便 简便 简便
菌种
金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
琼脂斜面低温保藏法
培养基
保存温度
营养琼脂斜面培养 基
疱肉培养基 改良马丁琼脂斜面
培养基
4℃
室温 4℃
传接时间 约1个月
约3个月
液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
菌种的管理和保藏
2020年5月17日星期日
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术 科学保藏和管理关系到检验结果的正确性.
菌种的—2015版指导原则
原则： 应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌 株所有相关特性等效的商业派生菌株。
使用菌种来源
菌种编号 2015版 CMCC —— 中国医学菌种保藏中心 CMCC（F）真菌 CMCC（B）细菌
菌种的保藏
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法： ⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落
⑵确定保藏的合适菌体形态 ⑶选择最适宜的方法保藏 ⑷定期检查
菌种的保藏
方法 液氮超低温保藏法
主要原理 超低温
适用的微生物 广泛
保藏时间 数十年
特点 复杂、需要专门设备，有效
冷冻真空干燥保藏法
干燥、缺氧、低温
分离技术
将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。
方法
平板划线 - 分段划线、连续划线 涂布分离法 倾注分离法等
培养
接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜 微生物生长的
环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。 需气菌培养法: 厌氧培养法
嗜温性微生物：15℃～45℃。
嗜热性微生物：45℃以上。
嗜冷性微生物：15℃以下。
培养后微生物的生长判断
固体培养基 有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。 液体培养基 浑浊、菌膜、沉淀等。
菌种的传代和使用
冻干菌种（0代） ↓
增菌培养 苏醒（1代） ↓
增菌培养 复壮（2代） → 分装冷冻保存 ↓
斜面培养基 划线传代（3代） → 使用→ 分装冷冻保存
规定培养基、培养、点计菌落数 ↓
实验、阳性对照
平板计数也可和试验同时进行
菌液制备用培养基—2015修订内容
修订前 营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；
修订后 胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤培养基；
改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基。
沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤培养基； 马铃薯葡萄糖琼脂 。
菌液制备用培养基—2015修订内容
常用菌种的保藏—2015指导原则
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌 种为第0代）。 采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 冷冻保藏：在低温下保藏，一般在低于-30℃或-70℃，是有效的长期储藏方法。 冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法法。 冷藏：在2～8℃保藏，是短期储藏方法。
保存条件 -80℃可保存数年.
菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
接种： 斜面培养基 半固体培养基 液体培养基 平板培养基