菌种保藏与管理
菌种保藏方法
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
菌种保藏管理制度
菌种保藏管理制度第一章总则第一条为规范和加强菌种保藏管理，提高菌种资源的利用率和保藏质量，制定本制度。
第二条本制度适用于菌种保藏单位的管理和操作。
第三条菌种保藏管理应遵循法律法规、国家标准和相关管理制度，保障菌种资源的合法、安全、有效性。
第四条菌种保藏管理应遵循科学性、规范性和合理性原则。
第二章菌种保藏管理制度要求第五条菌种保藏单位应有合格的菌种保藏人员，具有相关专业知识和操作技能。
第六条菌种保藏单位应具备完善的菌种保藏设施和设备，满足菌种的质量保护和管理需求。
第七条菌种保藏单位应制定菌种保藏管理规章制度，明确菌种资源的申请、保藏、使用和监管流程。
第八条菌种保藏单位应建立菌种信息数据库，对菌种资源进行准确、完整地记录和管理。
第九条菌种保藏单位应定期组织对菌种资源进行检测和鉴定，确保菌种的纯度和活力。
第十条菌种保藏单位应加强安全管理，确保菌种资源的安全使用和保护。
第十一条菌种保藏单位应建立菌种资源的追溯机制，对菌种资源的来源和去向进行记录和跟踪。
第三章菌种保藏管理流程第十二条菌种保藏单位应依法收集菌种资源，并进行鉴定和分类。
第十三条菌种保藏单位应按照规定对菌种资源进行保存和保藏，确保其质量和活力。
第十四条菌种保藏单位应制定菌种资源的使用管理规定，明确使用范围和条件。
第十五条菌种保藏单位应建立菌种资源的定期更新机制，确保菌种资源的新鲜和多样性。
第十六条菌种保藏单位应建立菌种资源的信息共享平台，促进菌种资源的交流和共享。
第四章菌种保藏管理监督第十七条有关行政部门应加强对菌种保藏单位的监督和检查，确保菌种资源管理的合法性和合规性。
第十八条菌种保藏单位应定期对菌种资源进行抽查和自检，发现问题及时整改。
第十九条菌种保藏单位应接受社会监督，加强与公众的沟通和交流。
第二十条对违反菌种保藏管理制度的单位和个人，依法给予相应的处罚和通报。
第五章附则第二十一条本制度自颁布之日起正式执行。
第二十二条本制度的解释权归菌种保藏管理部门所有。
菌种的管理和保藏
整理课件
液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时.
保存条件 -80℃可保存数年.
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菌种的传代和使用
工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传 代一次。
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基本操作技术
细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。
信息。
整理课件
2015版-指导原则
菌种的鉴定
纯菌的分离 微生物的表型 表型微生物鉴定 通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生 物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不 能完整表达其表型属性。 基因型微生物鉴定
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菌种的鉴定
微生物分类中使用的表型特征
整理课件
菌种的保藏
低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖， 因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。
整理课件
菌种的保藏
标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再 次使用。
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用 作
培养时间( h ) 18～24
2～3天
5～7天，或直到获得 丰富的孢子
整理课件
菌液制备用稀释液—2015修定内容
修订前 0.9％氯化钠溶液
修订后 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。
整理课件
菌液贮存—2015修定内容
修订前
修订后
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使 用。
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程
菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。
将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。
每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。
5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。
复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。
5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。
使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。
5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。
菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。
菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。
5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。
5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。
5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。
传代次数不宜过多，一般不超过10代。
5菌种的管理和保藏
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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可 以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、 干燥和真空是菌种保藏的重要手段。 标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可 将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分 装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存， 超低温冷冻(低于-70℃)等方法保存。
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⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法
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定期检查
主要检查项目 菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形
态、生化特性及血清学检查。
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菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过 程验室主要采用分离纯化的方法。
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⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体。 ⑶选择最适宜的方法保藏。 ⑷定期对保藏的菌种进行检查。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代， （从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止 过度的传代造成菌种变异。
1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任 何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要 时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。
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菌种的来源
药品微生物检验用的试验菌应来自认 可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株， 或使用与标准菌株所有相关特性等效的商 业派生菌株。
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菌种保藏的中心任务
⒈广泛收集各种有用的微生物菌种。 ⒉选择最适宜的保藏方法。 ⒊研究、检验、交换和使用。
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微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、前言微生物菌种的保藏是微生物研究中非常重要的一环，它对于保障菌种的长期保存和研究使用具有重要的意义。
本技术规程旨在规范微生物菌种的常规保藏技术，确保其安全、稳定和可持续使用。
二、常规保藏技术1. 冻干法（Lyophilization）：将培养的微生物菌株悬液在前冷冻过程中给予低温、高真空条件，使其中的水分直接从冰态升华为气态，从而避免了常规冻存法中由于结冰时水晶体的生成对菌体的危害，从而达到保存微生物菌株的目的。
操作步骤：a. 微生物培养物经适当稀释后应当倒入试管中，滴入约1ml 20%乳糖溶液在表面形成一层薄膜，待乳糖凝固后，在加入4ml 0.5-0.7%匀浆的2%干燥乳铁粉液，将试管摇匀，再灌入16ml混合液保持无气泡，放置于冰浴上。
b. 待培养物温度达到0摄氏度，再清洗喷雾器，灌入76％露醇20ml，培养物放入冷板上，适当时间后将试管封口放入冷板上经杀菌后真空泵连接，把真空泵打开，通过真空泵提供的条件慢慢降低压强，一般12小时后真空泵关闭。
c. 提供适当温度下作干燥处理，通常使用倍耐安减压干燥器空干40-80小时，干燥后的干燥灸试管，将试管放入吸气瓶中后置入-40—-50摄氏度低温冷冻管内低温保存(一般保存温度为—40摄氏度或更低)，备用空干矿温度—20摄氏度或更低。
2. 酶解冻存法（Enzymatic freezing）：在培养基中添加蔗糖，结合酶解冻存方法，经冻干后的菌种耐冻性和储存时间明显提高。
操作步骤：a. 将微生物分别接种于琼脂平板上，预培养24小时，取2-3份储备品。
菌液于冻干菊花瓶中进行前冷冻，真空抽气消耗20分钟。
b. 平均地用EP管管接受，采用3次“起冻—冷冻”的方法完全冻干，最后0.1至0.3ml真菌液在5摄氏下冷冻6小时，然后在5摄氏下还原18小时。
c. 移除冻存，延长试验保存时间。
必须在-80摄氏下保存。
3. 液氮冻存法（Liquid nitrogen freezing）：液氮冷冻法是现在应用最广泛的冷冻保存方法，在液氮的作用下，微生物菌种在-196摄氏度下冷冻，保持良好的生物活性。
菌种保藏管理
菌种保藏管理菌种保藏管理是指对微生物菌种进行保存、管理、鉴定和利用的一系列工作。
菌种保藏管理的目的是保护微生物资源，促进微生物资源的研究和利用，防止微生物污染和传播，维护科学研究的诚信和公正。
一、菌种保存菌种保存是指将微生物菌株保存在适宜的条件下，以保证其生命活力和遗传稳定性。
常见的菌种保存方式有以下几种：1. 冷冻保存：将菌株在-70℃以下的低温条件下保存，可保存数年至数十年。
2. 干燥保存：将菌株在低湿度条件下干燥保存，可保存数年至数十年。
3. 液氮保存：将菌株在液氮中保存，可保存数十年至数百年。
4. 长期培养：将菌株在适宜的培养基上连续传代培养，可保存数年至数十年。
二、菌种管理菌种管理是指对保存的菌株进行鉴定、分类、记录和更新等工作。
常见的菌种管理工作有以下几个方面：1. 鉴定和分类：对保存的菌株进行鉴定和分类，确定其种属和亚种。
2. 记录和更新：对保存的菌株进行详细的记录和更新，包括菌株来源、保存时间、保存方式、鉴定结果等信息。
3. 质量控制：对保存的菌株进行质量控制，包括检测菌株的纯度、活力和遗传稳定性等指标。
4. 分发和交换：将保存的菌株分发给需要的研究人员或机构，或与其他机构进行菌株交换。
三、菌种利用菌种利用是指利用保存的菌株进行科学研究和应用开发。
常见的菌种利用方式有以下几种：1. 研究应用：利用保存的菌株进行科学研究和应用开发，如发酵生产、药物研发、环境修复等。
2. 教学实验：利用保存的菌株进行教学实验，培养学生的实验技能和科学素养。
3. 保护利用：利用保存的菌株进行保护利用，促进微生物资源的可持续利用和保护。
总之，菌种保藏管理是保护微生物资源、促进科学研究和应用开发的重要工作，需要科学规范的管理和操作。
生物安全实验室病原微生物菌(毒)种和生物样本的保存(保藏)
生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。
无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。
一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。
”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。
《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。
病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。
《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。
有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。
重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。
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菌种保藏方法 –液氮超低温保藏法
方法：将成熟期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一 密封。冷冻后治愈液氮中保藏。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：数十年。 优点：适用范围广，保存时间长。 缺点：设备特殊。 注意事项：注意液氮的存量；所用的保存管可耐受大的温差； 菌种复苏时需迅速解冻。
菌种保藏方法 –液体石蜡保存法
方法：将微生物接种至培养基斜面上或半固体高层培养基中，按 规定的温度和时间培养。加入灭菌、干燥的液体石蜡，置于4℃左 右的冰箱中保藏。 适用范围：适用于部分霉菌、酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果 较差。 保藏时间：1年以上。 优点：操作简单，不需要特殊设备。 缺点：保保存时必须直立放置, 所占位置较大, 不方便携带。 注意事项：严格控制液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度，一 般以高出1cm为宜，液体石蜡需保持干燥。
菌种保藏方法 –沙土管保藏法
方法：将微生物的新鲜培养物接种至灭菌的沙土管中，使菌体或 孢子依附在沙粒上混合均匀再干燥保藏。 适用范围：适用于部分霉菌、酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果 较差。产孢芽孢的细菌，产孢子的霉菌和放线菌，对营养细胞效 果 不佳。 保藏时间：1-10年。 优点：设备简单 。 缺点：操作较复杂，适用范围小。 注意事项：沙土管一旦接种好，应立即干燥，一般在12小时内抽 真空干燥。
• 低温、干燥、缺氧是菌种保藏的重要手段。
菌种保藏方法
• 传代保藏法 • 液体石蜡保存法 • 沙土管保藏法 • 冷冻保藏法 • 冷冻真空干燥保藏法 • 液氮超低温保藏法 • 麸皮保藏法 • 滤纸保藏法 • 半固体穿刺保藏法
菌种保藏方法 –传代保藏法
方法：将微生物接种至培养基斜面上，按规定的温度和时间培养， 待充分生长后，将斜面置于4℃左右的冰箱中保藏。 适用范围：细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等。 保藏时间：1-6个月。 优点：操作简单，不需要特殊设备。 缺点：保藏时间短，传代次数多，易发生变异和退化，易被污染。 注意事项：使用对数期或稳定期的微生物；需定期检查冰箱的温 度及菌种管是否包装完整；每次传代需要确认 微生物 特征及纯度； 铜绿假单胞菌不可直接置于冰箱 中保存。
菌种保藏方法 –冷冻干燥保藏法
方法：将微生物培养物 混合于有保护作用的介质内， 分装到无菌 的安瓿瓶中， 于低温冰箱中冷冻， 达到预定温度后对浓菌液进行 冷冻干燥处理，之后在真空状态下融封安瓿瓶中保藏。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：5-10年以上。 优点：保藏效果好，储存期长，存活率高，变异率低。 缺点：操作繁琐，需要一定的设备。 注意事项：真空干燥系统密封要好，真空度要高；预冻速度要快， 避免冰晶的形成。
国外菌种保藏机构
• 美国标准菌种收藏所(ATCC) • 法国巴斯德研究所菌物保藏中心 (CIP) • 英国国家典型培养物保藏中心 (NCTC) • 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(NCIMB) • 日本技术评价研究所生物资源中心 (NBRC)
菌种保藏的原理
• 根据微生物的生理、生化特性，在人工创造的条 件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞处 于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡， 以降低菌种的变异率。
1979年7月，在北京召开的全国第一届菌种保藏管理会议，正式成 立中国菌种保藏管理委员会（CCCCM），成立7个菌种保藏管理中 心： • 中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC (归口中国科学院) • 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC (归口中国农业科学院) • 中国工业微生物菌种保藏中心CICC (归口轻工业总会) • 中国医学微生物菌种保藏中心CMCC (归口卫生部) • 中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC (国家医药管理局) • 中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC (归口农业部) • 中国林业微生物菌种保藏中心CFCC (归口中国林业科学院)
菌种保藏与管理
菌种保藏： • 菌种保藏的意义 • 菌种保藏机构 • 菌种保藏技术 菌种管理
菌种保藏的意义
选择合适的保藏方法，避免在保藏期间和传代过程 中死亡、变异及衰退，以保持菌种原有的各种生物 学特性，并防止杂菌污染。在适宜条件下， 菌种可 重新恢复原有的生物学活性，进行生长繁殖。
中国的菌种保藏机构
菌种保藏的注意事项
游龙，2005
菌种管理
• 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 实验室必须建立和保存其所有菌种的进出、收集、贮藏、 确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件（从 标准菌株到工作菌株），该程序包括：标准菌种的申购记 录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转 种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认， 并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、 传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置 和条件；其他需要的程序。
菌种管理
• 药品生产质量管理规范（2010年修订）
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应 当至少符合以下要求： （六）应当有检验所需的各种检定菌，并建立检定菌保存、 传代、使用、销毁的操作规程和相应记录； （七）检定菌应当有适当的标识，内容至少包括菌种名称、 编号、代次、传代日期、传代操作人； （八）检定菌应当按照规定的条件贮存，贮存的方式和时 间不应当对检定菌的生长特性有不利影响。
菌种管理
采购 保存 确认 传代 使用 销毁
菌种管理
采购 保存 确认 传代 使用 销毁
菌种保藏方法 –冷冻保藏法
方法：将成熟期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一定体 积的无菌甘油， 使甘油的最终体积分数为10%~20%， 密封。可以 根据实验室的条件将菌种置于- 70 ℃冰箱， 或者- 20 ℃冰箱中保存， 温度越低保存时间越长。 适用范围：适用于各类微生物。 保藏时间：1-10年。 优点：适用范围广，保存时间长。 缺点：需要一定的设备。 注意事项：选取最合适的保护剂； 注意要“ 慢冻快化”： 冷冻时降 温速率保持1 ℃/min。