花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析
rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估
关键词 ： 内转 录间隔区 ； 因测序 ； 基 丝状真菌 ； 形态学鉴定
Ｅｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ＤＮＡ－ｎ ｅ ｎ ｌ ｔａ ｓ ｒｂ ｄ ｓ ａ ｅ ｅ ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｅｓ ｆ ｒ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｌ ｉａ ａ ｕ ｔｏ ｎ ｒ ｉ ｔ ｒ ａ ｒ ｎ ｃ ｉ ｅ ｐ ｃ ｒ ｒ ｇ ｏ ｓ ａ ａ ｇ ｔ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒ ｉ ｅ ｔ ａ ｉ ｆ ｃ ｉ ｃ ｌ ｉ ｆ ｏ ｎ
Ｔ ｅｆ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｌ Ｔ ｉ ｅ Ｂａ ｋ ａ ｔ — ｅ ｅ ａｉ ｇｓ ｓ ｍ ｒｐ ｙｏ ｅ ｅ ｉ ｔｅ ｎ ｏ ａ ａｉ ｅｉ ｄ ｃ ｔ ｒ ｗ ｓｈ ｌ ｆ ｌ ｏ ｈ ｃ ｉ ｆ ＡＳ Ｇ ｎ ｎ ｕ ｏ ｇ ｎ ｒｔ ｙ ｔ ｆ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ｒ ｅａ ｄ ｃ ｍｐ ｒ ｔ ｉ ａｏ ｓ ａ ｅ ｐ ｕ ｕ ｏ Ｂ ｎ ｎ ｅ ｏ ｃ ｖ ｎ ｔ ｄ ｔ ｒ ｎ ｈ ｉｈ ｈ ｍｏ ｏ ｏ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｓ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｕ ｄ ｂ ｏ ａ ｅ ｉ ｈ ｒ ｈ ｌ ｇｃ ｌｉｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ ｔｅ ｅ ｅｍｉ ｅ ｔ ｅ ｈｇ ｏ ｌｇ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ ． ｈ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｌ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗ ｔ ｔｅ ｍｏｐ ｏ ｏ ｉａ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｈ ｓ ｈ ｉ ｆ ｏ
ｃ ａ ａｔ ｎ Ｐ Ｒ）ａ ｐｉｃｔ ｎ ｎ ｈ Ｃ ｒｄｃｓｗ ｒ ｓｑｅ ｃｄ ａｄｃｍ ａｅ ｉ ｈ ａａｉ ｅＢ ｎ ． ｈ ｉ ｒ ｃｉ （ Ｃ ｎｅ ｏ ｍ ｌ ａ ｏ ，ａｄｔｅＰ Ｒ ｐｏｕｔ ｅｅ ｅｕｎ ｅ ｎ ｏ ｐｒｄｗｔ ｔ ｄｔ ｎＧ ｎ ａ ｋ ｉ ｆ ｉ ｈ ｅ
摘要 ： 目的 评价 内转 录间隔区（Ｔ ） ＩＳ 的多态性序列分 析（Ｄ Ａ ＩＳ序列分析 ） 临床少 见丝状真 菌的鉴定 ｒＮ — Ｔ 对 作用 ， 以形态学 鉴定方 法加 以补充验证 。方法 将 ３株待检 真菌通过 聚合 酶链 反应 （ Ｃ 扩 增和基 因测 序方法 Ｐ Ｒ）
ITS简介
利用ITS进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。
ITS是内源转录间隔区( Internally Transcribed Spacer)的英文缩写, 位于rRNA 编码基因18S,5. 8S和28S之间的小基因片段。
其优点有: 具有高拷贝数,整个序列的长度在600～800 bp，利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列, 能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rRNA基因(rDNA)在微生物的鉴定应用中，具有检测微生物种水平的多态性特征。
这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。
每个重复的rDNA 序列的存在方式为由一前一后的18S rDNA 小亚基单元(SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亚基单元(LSU)组成,已设计出通用引物来扩增ITS序列分析相关真菌种水平之间的差异。
本研究通过丝状真菌ITS保守序列的扩增, 同源序列的对比分析 ,结合传统鉴定方法,对从土壤中分离筛选的一株丝状真菌进行了分析鉴定,并对鉴定结果和方法进行了比较分析。
种内变异还显示在rDNA基因间内转录间隔区Ⅰ和Ⅱ（分别为ITSⅠ和ITSⅡ）的片段大小上。
ITS区在核糖体DNA中进化较快，可在同一属间甚至群体间发生变化。
其中ITSⅡ区在种间变异性较高（22％），种内变异性较低（＜3％）。
选择的两对引物均以ITS区的序列为靶目标，其中引物①（ITS1和ITS4）扩增的是ITSⅠ区、5.8SrDNA和ITSⅡ区的基因序列，可以鉴别出念珠菌属的3个菌种；引物②（ITS4和ITS86）扩增的是5.8S rDNA和28S rDNA之间的ITSⅡ区的保守顺序，可以鉴别出念珠菌属的7个菌种。
因而笔者更推荐采用引物②，它不仅有很强的通用性，能识别更多菌种，而且具有更高的属种特异性。
1、通用引物①：ITS1 5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3’ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’通用引物②ITS4 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3’ITS86 5'-GTGA ATCA TCGA ATCT TTGA AC一3’2、反应体系（50μL）10×buffer 5 μLMg2＋ 4 μLdNTPs 4 μL 可以加到一起，再分装上游引物（ITS4） 2 μL下游引物（ITS86） 2 μL 加完试剂后，稍加离心。
【国家自然科学基金】_内转录间隔区(its)_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140801
推荐指数 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
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2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
科研热词 序列分析 内转录间隔区(its) 种系发育关系 物种鉴定 内转录间隔区 its序列 黄鳝 香蕉枯萎病菌 铁皮石斛 鉴定 车前草白粉菌 车前草 蛇钩口线虫 蛇蛔虫 膜荚黄芪 胃瘤线虫 羌活 系统发育分析 稳定性 白粉菌 白粉寄生孢 生物学特性 单孢分离 分子系统学鉴定 凤仙花 准确性 亲缘关系 rdna-its序列 rdna pcr its/its2 its
推荐指数 3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
转录间隔区_ITS_在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展_牛庆丽
中国兽医寄生虫病 2008,16(4):41 47 Ch i nes e J ournal of Veteri nary Paras it ology收稿日期:2008 01 29基金项目:国家自然资源平台项目(2005DKA 21100);国家自然科学基金项目(30571397);国家高技术研究发展计划(863)项目(2006AA 10A 207);科技部欧盟项目专项经费;中国农业科学院杰出人才基金、欧盟EP IZONE 、ICTTD3(I NCO N o ,510561);SS A I N COM E 项目作者简介:牛庆丽(1981~),女,河南人,研究生,基础兽医学专业。
通讯作者:殷 宏,E ma i:l tt bdcn @pub lic .lz .gs .cn文献综述转录间隔区(I TS)在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展牛庆丽, 罗建勋, 殷 宏(中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046)摘 要:在寄生虫分子分类学研究中,利用核糖体DNA 对寄生虫进行分类学,以及虫种进化关系学的研究,已经成为国际上普遍应用的方法。
但由于它具有高度保守性的特点,所以很难在同种异株的区分上有所作为。
内转录间隔区ITS 是位于寄生虫的遗传物质特别是核糖体DNA (r DNA )上18S 和28S 基因之间的区域片段,由于它在生物种和亚种间变异较大,从而可以用来进行动物原虫种间以及株间的分类鉴定。
因此,在分子分类学领域,越来越多的采用核rDNA 的内转录间隔区(I TS)作为分子标记。
本文介绍ITS 作为分子标记在寄生虫分子分类中的作用及其进展。
关键词: rDNA I T S ;寄生虫;分子标记;应用中图分类号:S852.7 Q 523 文献标识码:A 文章编号:1005 0868(2008)04 0041 07ADVANCES AND APPL ICAT I ON OF RDNA ITS I N THEMOLECULAR TAXONO MY OF PARASI TEN I U Q ing l,i LUO Jian xun , Y I N H ong(S t ate K ey Laboratory of Veter i nary E tiolog ical B iology /K ey Laboratory of A ni m alP arasit o logy of Gansu Pror i nce ,L anzhou Veter i nary R esearch Institute ,CAAS,Lanzhou 730046,Chi na)Abstract :It is a genera lm ethod t h at usi n g riboso m e RNA gene to i d entify the parasites and study the spec i e s evo l u tion re lati o n in mo lecular taxono m y ,H o w ever ,r RNA is very conservati v e there is little change a m ong stra i nw it h i n one species ,so it is very d ifficu lt to i d entify d ifferent stra i n s o f ho m ogene ity .I T S r DNA,l o cati n g bet w een 18S and 28S,has ver y h i g h var i a ti o n i n bio l o g ica l species ,w as and can be used to d istingu ish of an i m a l pr o tozoon species .Recen tl y ,m any papers on m olecular taxono m y o f parasitesw ere pub lished usi n g I T S as a m olecule m ar k er .The paper descri b ed t h e r o le and prog ressi o n of t h e I T S as a m o lecu le m ark i n parasite m o lecu le classification . K ey w ords : r RNA I TS ;parasite ;m olecule m arker ;app licati o n 20世纪80年代以来,分子生物学技术在各个研究领域得到了广泛应用,分子生物学分类也成为寄生虫分类学研究的新途径。
rDNA ITS 序列分析在植物种属鉴定中的应用与研究
rDNA ITS序列分析在植物种属鉴定中的应用和研究黄凤玲遵义医学院珠海校区（广东珠海，519041）摘要：rDNA ITS序列分析方法用于植物系统种属鉴定与进化研究有较高的可靠性。
由于高等植物rRNA基因上的18SrDNA、ITS及5SrDNA片段常具有变异位点[1]，通过DNA序列测定核基因组的rDNA ITS 序列，根据测序结果进行比较就可以鉴定植物的种属关系，对于植物的鉴定有非常重要的意义和作用。
关键词：rDNA ITS序列；植物；种属鉴定分子生物学研究发现，生物种类所依赖的资源—“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性又直接体现在DNA分子水平上的检测。
21世纪以来，现代分子生物学技术在植物的研究取得突破性进展，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术便得到验证，为不同植物的分类、鉴定等提供了更丰富、更可靠的手段。
其中，核糖体基因（rDNA）的内转录间隔区（ITS）在植物的种、属鉴定的研究得到广泛的应用。
1 rRNA基因（rDNA ）的基本结构及ITS区高等植物中有4种rRNA,即 5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA，前三者的基因组成一个转录元，是高度重复的串联序列单位。
近年来，随着分子生物学技术在生物系统研究等领域的广泛应用，以PCR为基础的各种分子生物学技术在植物鉴定方面的应用报道日益增多。
rRNA基因（rDNA ）是目前分子系统研究中普遍采用的分子标记基因之一，它是一种中等重复并有转录活性的家族。
核糖体RNA及其相邻的间隔区合称为rDNA [2]。
rDNA中存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，它们的不同区域可反映物种不同的进化水平。
真核细胞rDNA有几十甚至数千个拷贝，其中2个内部转录间隔区ITS-1、ITS-2将18S、5.8S、28S分隔开；不同的选择压力作用于rDNA区域，造成单个重复单位序列不同的保守性。
每一部分都可以用作特殊的生物系统分析。
菌株 its 序列
菌株its序列简介菌株its序列是一种用于分析真菌的种属和物种鉴定的标志性分子位点。
在分类学和生态学研究中，通过检测和比较菌株中的its序列差异，可以对真菌的分类、进化和多样性进行深入的研究。
its序列的定义菌株its序列即真菌内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，位于真核生物的rDNA中，包括ITS1、5.8S rRNA和ITS2三个区域。
其中，ITS1和ITS2是高变区，可以用于研究种属和物种间的变异。
ITS序列在物种鉴定中的应用ITS序列由于其具有高变性和物种特异性的特点，在真菌物种鉴定中得到广泛应用。
通过与数据库中已知的ITS序列比对，可以准确地将不同的菌株归类到其相应的物种或属级分类。
基于ITS序列的物种鉴定方法，可以实现快速、准确和高通量的真菌鉴定。
ITS序列的分析方法收集菌株样本在进行ITS序列分析之前，首先需要收集菌株样本。
可以选择不同环境中的真菌，如土壤、水体、植物等，或者从已知物种中选取不同的菌株进行分析。
提取菌株DNA从收集的菌株中提取总DNA，可以利用商用的DNA提取试剂盒进行提取。
保证提取的DNA质量和浓度足够用于后续的PCR扩增反应。
PCR扩增ITS序列利用特异性引物对ITS序列进行PCR扩增。
常用的引物对包括ITS1和ITS4。
在扩增过程中，需要根据反应条件进行优化，如温度、循环数等。
扩增后的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
分离和纯化PCR产物对PCR扩增得到的产物进行分离和纯化。
可以使用商用的PCR产物纯化试剂盒，或者通过凝胶切割和DNA回收的方法进行纯化。
测序和序列比对将纯化的PCR产物进行测序，可以选择传统的Sanger测序方法，也可以选择高通量测序技术。
得到测序结果后，进行序列比对，可以使用BLAST等序列比对软件进行比对和比对结果的分析。
物种鉴定和系统发育分析根据ITS序列比对结果，可以进行物种鉴定和系统发育分析。
ITS区域全长序列
百泰派克生物科技
ITS区域全长序列
ITS（internal transcribed space）是存在于真核生物中的一段rDNA转录间隔区。
rDNA是编码核糖体RNA（rRNA）的基因，由转录区和非转录区组成，转录区包括
18S、5.8S和28S rDNA基因，内转录间隔区ITS位于18S和5.8S rDNA之间以及
5.8S和28S rDNA之间。
ITS序列长度适中，从酵母到人类的各种真核生物中，ITS的序列长度在300-
1000bp之间不等。
其序列进化速度快，在不同种属物种之间具有一定的特异性，
将其进行PCR扩增并设计成特异性引物进行 RFLP 或序列分析，可广泛用于不同生物型、菌株、种、属之间或之内的系统学研究，在物种分类与鉴定、种质资源鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系、系统发育研究与病原诊断等方面具有重要意义。
百泰派克生物科技采用基于Illumina高通量测序平台结合自主生信分析平台，提
供高效快速的ITS区域全长序列分析一站式技术包裹，包括实验设计、样品检测、数据分析等全套专业服务，还可根据不同需求提供高级定制分析欢，迎免费咨询。
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用
rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【摘要】采集了四川马尔康地区3种真菌,根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱,初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种.为提高鉴定的准确性,通过构建基因池;用特异性引物进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序;将测得的实验样品的序列在GeneBank中进行BLAST比对;并与相似性较高的已知的种,利用DNA-MAN、Clustalx1.83和MEGA5.0软件采用N-J法构建进化树,探寻他们与已知物种的相关关系.结果表明,三种疑似菌株扩增出的目的条带为500-750bp,J1、J2、J3号菌株分别与臭黄菇、松乳菇、红菇的序列相似度最高.并利用序列的相似性做出了它们各自的进化树.最终得出结论:J1号菌株为臭黄菇(Russula foetens),J2号菌株为松乳菇(Lactarius deliciosus),J3号菌株为红菇(Russula.).利用rDNA-ITS序列分析法和形态学分类法相结合的方法鉴定菌种,不仅丰富了三种真菌的基因库,而且也克服了单纯的rDNA-ITS序列分析法因受基因库的完善程度、高度相似性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等限制而不能鉴定出所有真菌的缺点,提高了真菌分类鉴定中一些模糊性状的区分度.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】6页(P264-269)【关键词】真菌;鉴定;rDNA;ITS;PCR;测序【作者】朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】Q939.5传统的真菌鉴定方法主要通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验来鉴定。
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花生内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析摘要设计1对特异引物,以花生栽培种四粒红及其与野生种光叶花生的种间杂种为材料,对花生its1-5.8s-its2序列进行高保真pcr扩增,获得长度约800bp的单一条带,在对pcr产物进行克隆测序的基础上构建了花生属进化树。
关键词花生;内转录间隔区(its)序列;pcr;进化树中图分类号q789文献标识码a文章编号1007-5739(2009)08-0103-02内转录间隔区序列(its)广泛应用于被子植物系统进化研究,为禾本科、大豆属、棉属等植物的系统进化研究提供了宝贵的分子遗传学依据。
花生rdna有关研究报道较少,尽管有分离 rdna its的报道,但未在此基础上进行花生属植物的系统发育分析。
本研究对花生its序列进行分离、测序,并将其与genbank中登录的花生its 序列进行比较和分析,为花生的系统演化及花生的分类鉴定提供分子水平的证据。
1材料与方法1.1材料试验所用花生为栽培种四粒红(silihong)及四粒红与野生种光叶花生的杂交后代(silihong×arachis glabrata benth.)高世代材料。
花生种子取自山东省花生研究所莱西试验站。
根据bhagwat等报道的its序列,使用软件sergene.v7.1设计1对特异引物:its1&2-1∶5’-gtcgatgccgcacaaaccaggatt-3’its1&2-2∶5’-cgggcacaacggggctctca-3’这对引物的扩增区包含its1、5.8s和its2完整区域。
引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
1.2方法取3~5粒花生未成熟的叶片置于1.5ml离心管中,加40μl0.25mol/l naoh,用1ml枪头套一pcr管将叶片捣碎,煮沸30s,加160μl含pvp-40的tris-hcl(ph值7.6),煮沸2min,10 000rpm离心5min,取上清液4℃保存,用时取1μl作模板。
取1-1d4-1、1-4d4-1、四粒红各品种未成熟叶片按上述步骤作简单处理,依次编号为1、2、3作为pcr模板。
pcr程序为:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃1.5min)30个循环,72℃ 10min。
先用takara taq dna聚合酶作pcr,确定有预期分子量大小的条带后再用高保真pfu dna聚合酶扩增,切胶回收dna,连接转化后挑取阳性克隆测序。
利用sergene.v7.1进行多序列比对。
用mega4.0软件以拟南芥核rdna序列为外群组(outgroup),采用3种方法(nj、me、mp)构建进化树,并进行bootstrap analysis 1 000检验[2]。
2结果与分析2.1its区序列的pcr扩增以总dna为模版,利用所设计的 2条引物pcr扩增出its区的特异性条带,分子量在800bp左右(图1),与genbank所登录的its序列片段长度相近。
用taq dna pol pcr体系和pfu dna pol pcr体系所扩增出的its区序列片段电泳迁移率相同。
2.2its1-5.8s-its2序列测定与多序列比对四粒红与野生种光叶杂交后代扩增产物6份穿刺培养物测序得到3条有差异的条带,分别命名为1-1、1-2、1-4。
四粒红扩增产物测序后得到的序列命名为3-3。
通过比对发现4条序列在its1-5.8s-its2区共有单核苷酸多态性位点14个,其中6个位于its1区,2个位于5.8s rdna中,6个位于its2区,其他植物上的研究认为5.8s rdna在进化上相当保守,而its1和its2则变化很大,本试验结果与这一结论一致。
2.3花生属进化树构建通过nj、me和mp法构建花生属进化树,其拓扑结构大致相似,但也有所区别。
总体看来,各个区组的材料分别聚集到一起,与基于传统形态学特征的花生属区组划分基本一致。
从本研究所构建的3棵进化树来看,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组在花生属中是比较原始的,花生区组(a)进化程度较高;gregory等根据花生属种间可交配性提出围脉(ex)区组、直立(er)区组和根茎(r)区组原根茎系较原始,而花生(a)区组、三籽粒(tris)区组、大根(c)区组、异形花(h)区组、匍匐(p)区组以及根茎(r)区组真根茎系进化程度较高。
研究结果表明,围脉(ex)区组、三籽粒(tris)区组和异形花(h)区组亲缘关系较近;直立(er)区组和三叶(trie)区组关系密切,两者与匍匐(p)区组形成一大的分支。
在本研究构建进化树所涉及的花生材料当中,有3个未命名的种,其区组归属尚不明确,但从所构建的进化树上看,a.sp.dap-2004-1、a.sp.dap-2004-2应属于花生(a)区组,a.sp.dap-2004-3可能属于直立(er)区组或匍匐(p)区组。
本研究所得4条序列均与花生区组的序列聚为一类,其中1-1、1-4与四粒红(3-3)关系相近,而1-2与其关系较远,说明种间杂种既与母本有相似的地方,也与母本有一定的差异,为杂种的真实性提供了分子水平证据。
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