DNA合成仪
引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC的区别
引物纯化方式HAP、PAGE、DHLPC等的区别纯化方式：一OPC纯化OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向层析柱（美国Waters 公司生产),根据DNA保护基(DMTr基)和层析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于90%，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等。
此级别对短链较为有效。
具体操作方法如下。
1. DNA 合成是用全自动DNA 合成仪从3‘ →5‘ 进行人工合成的。
在刚合成完的DNA 的5‘ 端的碱基上带有一个大型的疏水性保护基团DMTr 基，而中间产物的短链杂质DNA 中不具有DMTr 基。
利用这一性质进行目的DNA 的纯化。
2. 把粗样DNA 加入Sep-Pak Cartridge 柱上（简易反相柱) 。
此时，所有的合成产物全吸附于反相柱上。
3. 用甲醇清洗反相柱。
此时，吸附能力强的带有DMTr 保护基的目的DNA 仍吸附于反相柱上，而短链杂质DNA 片段全部被冲走。
4. 向反相柱上加入强酸TFA (Trifluoroacetic acid) , 切断DMTr 保护基和目的DNA 之间的连接。
5. 再用乙腈洗脱目的DNA 。
此时回收出来的目的DNA 的纯度能达到95% 以上。
可用于DNA 测序等。
二 PAGE纯化PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的纯度大于95%，对长链Oligo DNA的纯化特别有效。
适用于PCR用引物，DNA测需用引物，各种探针等。
三 HPLC纯化采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。
适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。
HPLC 纯化HPLC 纯化是使用高效液相色谱仪，对目的DNA 片段进行纯化的方法。
HPLC 纯化的设备投资大，生产成本高，但使用本法纯化的 DNA 片段纯度极高，大于99% 。
四种常见PCR仪的区别及运用-科邦实验室-2020.6.24
四种常见PCR仪的区别及运用PCR扩增仪（俗称PCR仪）PCR：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
1). 普通PCR仪（2万以下，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。
如果要做不同的退火温度需要多次运行。
主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。
如:启步BSW-2P,BSW-3P,BSW-6P-I/II ,ABI 2720型2). 梯度PCR仪（2万-8万，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。
因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。
用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。
生物化学习题—核酸
第五章核酸A1．DNA合成仪合成DNA片段时用的原料是_____D___。
A．4种dNTP B.4种NTP C.4种dNDP D.4种脱氧核苷的衍生物A2．假尿嘧啶核苷是指_____D______。
A.碱基并非尿嘧啶B.作为DNA的稀有碱基存在C.核苷中糖被甲基化D.糖与碱基之间的连接与正常不同3．稀有碱基主要存在于______C____中。
A.软色体DNAB.rRNAC.tRNAD.mRNA4．以下结构式的正确命名是________。
A.尿苷B.尿嘧啶C.尿苷酸D.胞苷酸A5．稀有核苷酸碱基主要是在哪类核酸中发现？___C_____A.rRNAB.mRNAC.tRNAD.核仁DNAA6.绝大多数mRNA的5’端有__B_____。
A.polyAB.帽子结构C.起始密码子D.终止密码子7．真核生物mRNA的帽子结构中，m7G与多核苷酸链通过三个膦酸基连接，连接方式是____D____。
A.2’—5’B.3’—5’C.3’—3’D.5’—5’8.原核mRNA与真核mRNA的结构在许多方面不相同，在下列4种结构中，原核mRNA不具有____①____,真核mRNA不具有____②____。
A.SD序列B.Poly（A）序列C.启动子序列D.内含子序列9．细胞质中主要有三种RNA：tRNA、mRNA和rRNA，其相对含量是___C______。
A.tRNA﹥mRNA﹥rRNAB. tRNA﹥rRNA﹥mRNAC. rRNA﹥tRNA﹥mRNA 10．DNA受热变性时，出现的现象是___B______。
A.多聚核苷酸链水解成单核苷酸B.在260nm波长处的吸光度增高C.碱基对以共价键连接D.溶液黏度增加E.最大光吸收峰波长发生转移11．某双链DNA样品含15%的A,该样品含C为____A______。
A.35%B.15%C.30%D.20%12．根据Watson—Grick模型，求得每1μmDNA双螺旋核苷酸对的平均数为__D__。
DNA合成仪
不同型号DNA/RNA合成仪的特点与性能简介
PE公司391型DNA／RNA合成仪
美国贝克曼公司01ig01000系列DNA合成仪
DNA合成仪的使用方法操作步骤
1)仔细检查合成仪上所有试剂瓶中的试剂量，必要时换掉试剂瓶，特别注 意乙腈的量，因为该溶剂用量较大。 2)将标记好的清洁的收集瓶装在合成仪上。 3)将要合成的DNA序列输入合成仪。 4)检查选择的合成步骤是否正确。 5)选择结束方法：TritylOffAuto是仪器的原始状态，若打算以5，—DMT基 团连接纯化寡核苷酸，将其转变为TritylOnAuto结束状态。 6)选择结束方法，一般为系统的原始状态。 7)在每个柱监视器的Username下，输入你所希望的保存名字。 8)以代码代替相应的DNA序列标记每一个收集瓶。 9)打印出每一个柱设置的详细资料。 10)检查打印出来的资料是否正确。 11)运行StartColumn步骤检查每一个柱的位置，确保合成仪上合成柱处于 正确的位置。 12)检查连接在合成仪上的溶剂残留(废液瓶)是否充满。 13)如果分部收集器用来收集每个DMT脱保护步骤的流出物，确保试管充分 清洁干净，并打开分部收集器，确保DMT废液管路通向分部收集器。 14)启动循环，运行开始程序清洗试剂管路，除去原来的试剂。
DNA 合 成 仪
长达200个 核苷酸 每次循环12 ~15分钟
用于寡核苷酸化学合成的单体
寡核苷酸片段合成步骤
一、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在 CP苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得 游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合 成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此 中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时， 将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一 个碱基。 四、封闭(Capping) 缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后 的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐 和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷 酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷 酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
dna合成仪原理
dna合成仪原理DNA是构成生物基本遗传遗传物质的核酸，其序列的精确复制和修复对于生命的长期存在和演化的至关重要。
DNA合成仪是一种在短时间内合成高质量的DNA片段和基因组的设备，被广泛应用于基因工程、基因组学、药物研究和诊断等领域。
1. DNA合成基本原理DNA的合成是一种与模板依赖性的生化过程，需要引物（prmer）作为起始点，核苷酸单元（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）作为合成材料，以及酶（DNA聚合酶）作为催化剂。
合成过程中，引物与模板DNA相互配对，酶沿着模板链“读取”模板上的信息，依次加入适配的核苷酸单元，使合成链适配模板链。
反复循环直至合成结束，形成一条新的DNA链。
2. DNA合成仪的构成（1）固相合成化学载体固相合成技术是DNA合成过程中的关键技术，它可以在化学载体表面上合成DNA，同时可以利用高效液相色谱技术对DNA进行纯化和分离。
合成化学载体主要包括：- 硅胶：用于合成磷酸二酯键（phosphodiester bond）；- DNA修饰因子：用于定向控制合成反应；- 引物修饰因子：用于提高合成效率及反应稳定性。
- 化学发光系统：用于监测反应的进行情况；- 氨基酸保护缓冲剂：用于保护酶的氨基酸残基，同时也可以增加合成效率；- 光学系统：用于记录反应的光信号以及反应的质量；- 清洗和纯化装置：用于去除反应体系中的杂质和副产物，以及纯化DNA产物。
（1）引物的设计和配对DNA合成必须要有起始点，通常我们需要在所要合成的DNA片段的两端加上可互补的引物（primer），引物为一串短链的DNA或RNA，通常为18-30个核苷酸。
- 引物的长度和组成；- 引物的互补性；- 引物的位点选择。
（2）DNA链延伸在DNA链延伸过程中，首先需要将反应体系加热至95°C，使沉淀的DNA片段变为单链DNA。
然后将反应体系冷却至50-60°C，将引物加入体系中，引物与模板DNA序列互补，同时可以通过最优反应条件，使引物与模板DNA序列恰好在位点上完全互补，保证整个反应体系的效果。
2022版高考生物一轮复习第十单元现代生物科技专题专题二十五基因工程2试题含解析
专题二十五基因工程考点1 基因工程的基本工具与操作程序1.[2021某某某某阶段训练,12分]超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。
研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。
结合下图回答下列问题。
注:Hin d Ⅲ和Apa LⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。
(1)将图中的重组DNA分子用Hin d Ⅲ和Apa L Ⅰ完全酶切后,可得到种DNA片段。
(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶,理由是。
(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为。
为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的作探针与从受体细胞中提取的RNA进行分子杂交检测,分子杂交的原理是。
(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其氨基酸序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经获得所需的基因。
2.[2020某某示X高中联考,15分]南极某种鱼含有抗冻基因,如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。
请回答下列相关问题:(1)利用①过程的方法获取目的基因需要用到酶。
②过程中常需要用到的工具酶是。
(2)通过①、②过程成功构建的重组质粒,除目的基因外,还应该具备等。
(3)将目的基因导入番茄体细胞的方法是利用农杆菌的作用,其原理是。
(4)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中表达出相应的蛋白质,可以采用方法,除进行分子检测外,有时还需要进行的鉴定。
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程3.[2021某某某某质量检测,12分]植物基因工程技术的发展为人类更好地利用盐碱地提供了可能。
请回答下列问题:(1)欲培育转基因耐盐水稻,需要完成的基因工程的核心步骤是,一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还必须有、以及标记基因。
(2)用PCR技术扩增耐盐基因的原理是,目前将耐盐基因导入双子叶植物最常用的方法是。
高中生物选择性必修三 第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具
科学家采用农杆菌转化法培养出第一例转基因烟草,此后,基 1983 因工程进入迅速发展阶段 1985 穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段
预习反馈 1.判断正误。 (1)通过基因工程产生的变异是不定向的。( × ) 分析该变异类型按人们的意愿进行,是定向的。 (2)通过基因工程改造成的生物为新物种。( × ) 分析通过基因工程改造成的生物,产生了新的性状,该生物与原来 的生物之间不存在生殖隔离,不属于新物种。 (3)基因工程育种与杂交育种相比的优点是打破了生殖隔离。( √ )
探究点一
探究点二
请讨论回答下列问题。
1.转基因抗虫棉是通过基因工程技术培育的,请完善下表,以准确把
握基因工程的概念。
别 名 重组DNA技术 操作环境 生物体外
操作对象
操作水平 DNA分子水平 原理
结果
创造出人类需要的新的生物类型和生物产品, 生物性状
答案基因 基因重组 定向改变
探究点一
探究点二
2.不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是什么? 提示(1)不同生物的DNA分子的基本组成单位都是4种脱氧核苷 酸;(2)不同生物的双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结 构;(3)不同生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。 3.外源基因能够在受体内表达,并使受体表现出相应的性状,为什么? 提示(1)基因是控制生物体性状的结构和功能的基本单位,具有相对 独立性;(2)遗传信息的传递都遵循中心法则;(3)生物界共用一套遗 传密码。
4.重组DNA分子的模拟操作
(1)材料用具:剪刀代表EcoRⅠ(限制酶),透明胶条代表DNA连接酶。
核酸合成仪安全操作及保养规程
核酸合成仪安全操作及保养规程核酸合成仪是现代分子生物学研究中的必备设备之一，利用化学合成方式快速合成核酸分子，广泛应用于基因工程、新药研发、生物技术等领域。
然而，由于操作不当、设备故障等原因，核酸合成仪在使用时存在一定的安全风险。
为保证使用者和设备的安全，需制定一套完善的核酸合成仪安全操作及保养规程。
一、设备基本情况核酸合成仪是以化学合成方式合成短合成单元序列（monomer）在聚合酶链反应时（PCR）充当合成起始物体，从而最终合成具有特定序列DNA/RNA的设备。
核酸合成仪通常包括化学耗材和合成仪两部分，其主要使用材料有固相合成的丙烯酰胺基短单体，固相合成载体、配体等。
二、核酸合成仪的安全操作规程1.设备摆放及环境要求•核酸合成仪应摆放在通风良好、无尘、防潮、安全稳定的实验室内。
•避免长时间暴露在阳光下或高温、低温环境中。
•如有液氮存储，不可直接接触设备，应与设备隔离。
•使用时需戴手套、实验衣、护目镜等个人防护设备。
2.合成操作规程•操作前应检查设备及配件是否完好，如有磨损、缺陷等应及时更换。
•操作前注意准备工作，如调配试剂、清洗操作台、准备盛装样品的试管和试剂等。
•留意设备是否处于运行状态，如有故障应及时停机并处理。
•操作时需使用设备自带的安全线（以光为导向），不得将其他电器设备接入核酸合成仪。
•操作过程中不得将试剂溅入机箱内部，避免液体进入装置或反应溢出装置。
•操作前应了解所要合成的核酸序列及对应试剂的标准量，避免出现操作失误。
3.化学品管理规程•化学品管理应按照国家和国际规定，贮存于具有防火、防爆、排风等设施的化学药品柜内。
•丙烯酰胺基短单体和其他与核酸合成相关的化学试剂，应分类储存，避免与其他化学品混在一起。
•化学试剂的使用应按照操作手册上要求。
如遇到泄漏或其他意外情况，应及时采取相应措施并上报相关负责人。
•操作后应及时清洗操作台、设备表面和固相合成载体等，避免残留物附着污染其他区域。
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N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
ETT Activator 5-Ethylthio-1H-tetrazole in acetonitrile, anhydrous
DNA合成仪
固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分 DNA自动合成仪 • • • • • • • 碱基柱 A、G、C、T亚磷酰胺单体 三氯乙酸(TCA)脱保护溶液 四唑偶联催化剂 乙酐，N—甲基咪唑封闭试剂 I2氧化混合物 乙腈清洗溶剂 氨水切除溶液
N1 DMTrO
纯化
根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯 化的方法。常用的纯化方法有：C18柱、 OPC柱、PAGE和HPLC。
定量
• 根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定 量。
其它标记引物
• 5'-Biotin-CE Phosphoramidite
• 3'-(6-FAM)-CPG
HO
O
CPG
OCH2CH2CN
N D M T rO
2
O P
N O
O C H 2C H 2C N
1
O
CPG
4.盖帽：为了防止未反应的与CPG相连的5’羟基在随后的 循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭， 常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪 唑等形成一活性很强的乙酰化试剂，与少量未参与连接反 应的5’羟基缩合成酯键。由于须封闭的羟基少且乙酰化 试剂活性高和充分过量，此步反应速度很快，几秒钟即足 够。太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可 能，且增加乙酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键 的危险性。 Cap (ABI) THF/Lutidine/Acetic Anhydride
N D M T rO
2
C H (C H 3)2
O P N
C H (C H 3)2
O C H 2C H 2C N
单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷 酸，含下面几个功能基团： 3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基。 3’位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 5’-DMT，保护基，缩合前脱去。 A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。 G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
O
CPG
欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1) 以其3′OH通过 1个长的烷基臂与固相载体【不溶性的高分子物质，常 用的有硅胶S、交联的聚苯乙烯、可控微孔玻璃珠 （CPG，controlled pore glass）等】耦联。CPG的孔 径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小 于40bp时，选择孔径500埃，链长大于40bp时，使用 1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%， 可以满足合成长达140bp的寡核苷酸的条件。 核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基（DMTr）保护。
dT-CE Phosphoramidite
1.脱保护基：用三氯乙酸（TCA）去除CPG所连核苷上的DMT, 以暴露5’羟基，供下一步缩合。此步需要注意TCA为一较强 的酸，可能会有脱嘌呤作用,故TCA与寡核苷酸接触时间不要 超过规定时间。 Deblock Mix (ABI) ：3% Trichloroacetic acid in dichloromethane N