药物制剂的微生物学检测

一、无菌检验的基本原则

1.严格进行无菌操作
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须 严格遵守无菌操作，防止徽生物污染。

2.建立方法的验证
进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明 所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或 原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。
2、取10个干烤后玻璃平皿，其中6个平皿，每2个分别加 入1：10，1：100，1：1000药液各1ml，然后加入50℃普 通琼脂培养基、（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）15ml做细 菌培养；剩余的4个平皿，每2个分别加入1：10，1：100， 药液各1ml共4个，然后加入50℃虎红马丁培养基15ml做 霉菌培养，并立刻转动平板使药液与培养基充分混匀。10 个平板置37℃培养箱培养24h后并计数每个稀释度的3个 平板的菌落均数。
3、选取菌落平均值在30-300之间的平板作为菌落总数
的测定范围，将数得的菌落数乘以相应的稀释度得到 每克检测蜜丸中细菌总数。选取霉菌菌落平均值在550之间的平板作为霉菌总数的测定范围，将数得的菌 落数乘以相应的稀释度得到每克检测蜜丸中霉菌总数。
菌落数报告规则

①当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落 数×稀释倍数报告菌数。 ②当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而 定。
大肠埃希菌是人和动物肠道中寄生的正常菌群，随粪
便排出体外，可直接或间接污染药物及药品生产的各个环
节。服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或寄生虫卵
等病原体感染。因此，大肠埃希菌被列为粪便污染指示菌， 是口服药品常规必检项目。
大肠埃希菌检查程序
供试品（1:10稀释）→ 供试液10ml
↓
不少于100ml的乳糖胆盐增菌液
↓37℃
18~24h
取增菌液划线转种
↓
伊红美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板）
↓ ┌────────────┐
阴性
菌落紫黑色、有金属光泽
乳糖发酵、IMViC试验
发酵乳糖产酸产气、 MViC：+ + - -

（1）增菌 目的:抑制不需要的细菌生长，而有利于需检菌 的生长。培养基:乳糖胆盐 (BL)培养基，作用:胆 盐(或去氧胆酸钠)具有抑制革兰阳性细菌生长的 作用。
-
+
M
- 甲基红（methyl red）实验
甲基红 甲基红 +
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 葡萄糖→丙酮酸
-
+
V
- VP（Voges-Proskauer）试验
葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 →二乙酰→红色化合物 +
胍基化合物 葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇 -
-
+
C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
方法：按该品种验证的方法将供试液10ml接种 至100ml的乳糖胆盐培养基中， 37℃培养18～24h， 必要时可延至48h。
（2）分离培养：
伊红美蓝琼脂(EMB)或麦康凯琼脂（MacC）平板
将上述培养液划线接种于伊红美蓝琼脂平板或麦康凯 琼脂平板，37℃培养18 ～ 24h 。若平板上无菌落生长、或 生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未 检出大肠埃希菌。 大肠埃希菌菌落形态特征
菌落均数 例次
1
稀释倍数
10-1 1365 10-2 164 10-3 20
比值
菌落总数 /g或 /ml 16400
报告方式 /g或/ml
-
16000
2
3
2760
2890
295
271
46
60
1.6
2.2
37750
27100
38000
27000
4 5
6
不可计 27
不可计
4650 11
305
513 5


原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。
药典中药制剂通则项下的微生物限度要求

无菌检查：注射剂。 无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制剂、 鼻用制剂、气雾剂*、喷雾剂。 微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏 剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、 酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏 剂(贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂. 不要求：膏药。



二、口服及外用中药的微生物学检查

口服制剂：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌和
活螨的检测

外用药物：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、破伤
风梭菌

一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆 菌、金黄色葡萄球菌 以上药物均不能检出致病菌！
实验方法
（一）、蜜丸细菌总数测定 （二）、蜜丸霉菌总数测定 1、无菌条件下随机称取10g蜜丸置研钵中逐渐加入100ml 生理盐水研磨为1：10药液，分别量取9ml生理盐水置 10ml 具塞刻度试管中，其中一支加入1：10药液1ml后稀 释为1：100后再取1ml加入9ml生理盐水具塞刻度试管中 药物稀释为1：1000。

（1）液体培养基稀释法：
在试管中用液体培养基进行2倍系列稀释药物→ 在每管 中加等量的试验菌液→ 16～24h培养→观察结果，以能抑 制试验菌生长的最低浓度（最高药物稀释度）为该药的 MIC。
液体培养基稀释法药敏试验的抗生素溶液稀释方案
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 抗生素原浓度 （μ g/ml） 5120(原液) 512 512 512 64 64 64 8 8 8 1 抗生素来源管号 原液 1号管（最终浓度，下同） 1号管 1号管 4号管（最终浓度，下同） 4号管 4号管 7号管（最终浓度，下同） 7号管 7号管 10号管（最终浓度，下 同） 取药体 积(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 CAMHB 体积（ml) 9 1 3 7 1 3 7 1 3 7 1 抗生素最终 浓度（μ g/ml ） 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 Log2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1
药物制剂的微生物学检查
第一节 中药制剂的无菌检查
灭菌制剂与无菌制剂的概念
灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所 有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。 无菌制剂：系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不 含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。 无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂； 创面用制剂；手术用制剂等直接注射于体内或直接用于创 面、黏膜等的一类制剂。 这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会 引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规 定的方法进无菌检查。
培 养 基 菌 落 形 态
呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明 伊红美蓝琼 脂（ EMB 平板） 显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有 金属光泽。
麦康凯琼脂
（MacC）
鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平， 边缘整齐，表面光滑，湿润。
划线接种于伊红美蓝琼脂平板
高稀释级的菌落数×稀释倍数 比值
＝
低稀释级的菌落数×稀释倍数
若比值＜2, 以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌 落数； 若比值＞2但＜5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值 报告菌落数； 当出现比值＞5，或高稀释级的菌落数≥低稀释级的菌落数等 异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重 新验证。
菌生长繁殖的一定量培养基中。
直接接种法图示
无抗菌 作用的 供试品 抽 样
培 养
接 种
细菌 37℃ 霉菌、酵母菌 25℃
接种于培养基硫乙醇酸盐培养 基及改良马丁培养基管
第二节 药物的微生物限度检查

药物的微生物限度检查，是指非规定灭 菌制剂（如口服药及外用药物）及其原、 辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。
大肠埃希菌在伊红美蓝琼脂平板 上的菌落特征
大肠埃希菌在麦康凯琼脂平板上 发酵乳糖菌落

（3）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态 （4）生化反应
主要是与产气杆菌进行鉴别，大肠埃希菌与产气杆菌两 者在形态、染色性、菌落等方面十分相似。因此，须通过 生化反应来鉴别。挑取可疑菌落做乳糖发酵试验和IMViC 试验——吲哚试验（I）、甲基红试验(M)、V-P试验(Vi) 和枸椽酸盐利用试验(C)试验。 结果：大肠埃希菌为+ + - 产气杆菌则为- - + +
（二）致病菌检测
阳性对照试验：
供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性
对照试验的加菌量为10～100 CFU，方法同供试品的控制
菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。
阴性对照试验： 取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对 照。阴性对照不得有菌生长。
（二）致病菌检测

1．大肠埃希菌的检查

3.相关试剂及培养条件
供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂， 应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。将供试 品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中， 在适宜条件下培养，细菌培养温度为30～37℃；霉菌、酵 母菌培养温度为23～28℃。

4.正确采集样品
无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整 体是否有菌的情况(无菌或染菌)。因此，在一批药品的无 菌检验中，取样数量愈少，染菌的检出率愈小；取样愈多， 染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。 无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。



如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在10个以下时，