狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。
另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。
结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。
结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 1101792. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。
狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用
狂犬病毒滴度检测噬斑法（PFU）的建立及应用
黄琼[1,2]
【期刊名称】《生物技术世界》
【年(卷),期】2016(000)003
【摘要】目的建立狂犬病毒滴度的快速、经济的检测方法-噬斑法（PFU）,验证其与小鼠脑内攻击法（计算LD50）的相关性,并用于PM株狂犬病毒的滴度测定. 方法狂犬病毒做10倍系列稀释,然后接种于单层BHK21细胞上, 37℃、5%CO2吸附1h后,加入覆盖液, 33℃、5%CO2培养7～10天后用1.5%的结晶紫染色.用建立的噬斑法和小鼠脑内攻击法同时测定狂犬病毒的滴度,以比较两种方法的相关性和重复性.结果两种方法测定狂犬病毒滴度的结果差异无统计学意义,相关系数为0.939,两种方法的检测结果呈良好的正相关性.结论噬斑法可替代小鼠脑内滴定法检测狂犬病毒滴度.
【总页数】1页(P318-318)
【作者】黄琼[1,2]
【作者单位】[1]四川大学生物治疗国家重点实验室,四川成都610041;[2]成都康华生物制品有限公司,四川成都610100
【正文语种】中文
【中图分类】R-33
【相关文献】
1.检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用 [J], 徐葛林;胡巧玲;吴杰;郑新雄;张燕
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3.狂犬病免疫抗体胶体金检测试纸法的建立及其应用 [J], 金颜辉;夏晓红;许先明;杨佳;吴波平;严乾临;林芬;巴雷
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直接免疫荧光法检测狂犬病毒滴度的可行性研究
收稿日期 : 2 01 1 -03 -ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 5 ; 修回日期 : 2 01 1 -04 -2 7 E - m ai l : 作者简 介 : 谈小 荣 ( 1 970 - ) ， 男， 医学 生 物助 理 工程 师 ， t x r 1 970 @ 1 6
o f ra bie sv iru s .R
re s ul t sw e recom pa re d for s e ns i ti v it y ，s pe ci fi cit y a nd re produ ci bil it y. I t wa sfou nd t ha tt h edFA i sa ss e ns i ti v ea nd s pe c ific a st h em o us ebra i n inocu l a t io nt e s tw i th h i g h re produ ci bi l i t y. T h edFA cou l d prov i dea na l te rna t iv efor th em ou s ebra in i no cul a ti on te s ti nt it ra t ion of ra bi e sv i ru s e s . K :R ; Dire ct im m u nofl u ore s ce nt a s s a y ; M ou s ebra i ni no cu l a t ion te s t; V i ru sti t e r
摘
2 1 331 6 ; 2 罗益( 无锡) 生物制药有限公司， 无锡 2 1 4 02 8 )
要: 实验研究中建立用于定量检测狂犬病毒滴度 的直接免 疫荧光 法， 并将检 测结果 与传统小 鼠脑内 滴定法 进
狂犬病诊断方法研究
健康养殖·诊疗2021.04 畜牧业环境79摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种高度致死性人兽共患性疾病，提高该病的诊断水平对保障人类健康尤为重要。
本文就狂犬病各种诊断方法的研究与应用现状进行综述，将为临床中快速诊断狂犬病提供参考依据。
关键词：狂犬病；诊断方法；研究进展1 前言狂犬病（rabies，RAB）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种高度致死性人兽共患传染病，近年来随着我国宠物行业的快速发展，犬科和猫科动物的异地流通加剧，RAB的发病率呈现出明显的上升趋势，提高RAB的诊断水平对该病的综合防控至关重要。
由于RAB引起的临床症状与其他致病原体导致的脑炎非常相似，故对于RAB的确诊需使用实验室诊断方法，一直以来RAB的实验室经典诊断方法为快速荧光灶抑制试验和荧光抗体试验，但两种方法存在操作繁琐、耗时、检测成本高、对试验条件和人员要求高等缺点，随着现代细胞培养技术、免疫学和分子生物学诊断技术的发展，RAB的新型替代诊断方法得到了快速发展，本文就RAB的各种诊断方法的研究与应用情况进行综述，以期为临床中RAB的快速确诊提供参考依据。
2 临床诊断依靠本病典型的临床表现即可做出初步诊断，愈合的咬伤伤口及伤口周围具有麻木发痒或蚁走感，临床表现出极度兴奋或烦躁，对风、水、光、声等外界刺激的敏感性增强，具有“恐水”症状，感染后期出现肌肉瘫痪或颅神经瘫痪。
3 实验室诊断3.1 荧光抗体试验该方法是实验室诊断RAB抗原的经典方法，将采集的临床样品与荧光素标记的抗RAB高免抗体进行反应，通过显微镜观察与抗原结合后的荧光抗体即可判断出样品中是否含有RAB抗原。
3.2 荧光灶抑制试验该方法是实验室诊断RAB抗体的经典方法，将采集人或动物的血清与RABV等量混合，置于37℃下中和反应1h，然后将抗原抗体混合物接种细胞并培养1d，次日对接种的细胞进行固定后进行荧光抗体染色，荧光显微镜下观察荧光灶个数，计算血清抗体效价。
狂犬疫苗介绍
成大生物狂犬病疫苗一）技术来源1984 年11 月，世界卫生组织（WHO ）和洛克菲勒基金会（RF）开始一项合作项目——以Vero 细胞为基质工业化生产狂犬病疫苗。
历时15 年的努力，科学有效地解决了生产、纯化中的诸多问题。
1999 年，该技术生产的高品质人用狂犬病纯化疫苗首先被批准在哥伦比亚使用，经过5年的实践，证明具有卓越的安全性和免疫效果。
该技术的核心在于实现了细胞的悬浮培养。
（二）主要技术1、高密度微载体技术1）微载体的诞生实现了细胞从贴壁生长到悬浮培养的革命。
成大速达? 的微载体技术指标：1 个微载体= 180 μm1 克微载体（干重）= 4,400cm 2500 克微载体= 1,000 转瓶（3 升转瓶）7.5 升反应器= 150 克微载体= 350 转瓶30 升反应器= 750 克微载体= 1,750 转瓶细胞密度: 10 x 106个细胞/ml细胞生长30 L 生物反应器= 7 天病毒生长天数= 20 天从上图我们可以看到细胞在微载体表面生长的非常好，细胞密度达107/ml 。
刚才已经谈过，巴斯德PV2061 狂犬病固定毒毒株是WHO 公认的免疫原性高的Vero 细胞适应株，因此，接种病毒后，连续收获病毒的滴度很高，这样从技术上就保证了成大速达?0.5ml 的小剂量里面，能够含有较高的抗原蛋白和较少的杂蛋白。
2）生物反应器为大规模细胞培养提供了设备支持。
全自动、封闭式、管道化的生物反应器3）比照传统生产工艺，微载体高密度细胞培养的优势：* 高细胞密度* 高病毒收获* 低污染的机会* 生产工艺可控性强* 微载体投放量高达25g/L ，细胞密度高达1.1-1.5x107/ml ，远超过其他工艺(转瓶、细胞工厂、其他类型反应器) 。
2、四柱层析纯化系统从前面的工艺流程中，我们已经知道，收获的病毒液必须经过无菌连接的管道化的澄清过滤和超滤浓缩后，灭活，然后，进行层析纯化。
下面的图中显示先进的纯化设备和训练有素的工作人员在操纵全自动的装备，经过这道关键的工艺后，有效地去除99.95%的杂蛋白和Vero 细胞DNA ，保证了成大速达?具有卓越的安全性。
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
人用狂犬病疫苗效价测定法(nih法) 附疫苗(vero 细胞+地鼠肾细胞)技术资料
人用狂犬病疫苗效价测定法（NIH法）本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。
试剂稀释液（PBS）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种11～13g小鼠，不少于8只，每只脑内接种0.03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入含2%马血清或小牛血清制成20%悬液，经每分钟1000转离心10分钟，取上清液经病毒滴定（用10只18～20g小鼠滴定）及无菌检查符合规定后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1∶25、1∶125和1∶625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12～14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100个LD50的病毒量进行脑内攻击，每只0.03ml。
同时将攻击毒稀释成100、10-1、10-2和 10-3进行毒力滴定，每个稀释度均不少于8只小鼠。
小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
计算供试品和参考疫苗ED50值。
计算相对效力P＝T/S×dT /dS×D式中P为供试品效价，IU/ml;T为供试品ED50的倒数；S为参考疫苗ED50的倒数；dT为供试品的一次人用剂量，ml；dS为参考疫苗的一次人用剂量，ml; D为参考疫苗的效价，IU/ml。
【附注】（1）动物免疫时应将疫苗保存在冰浴中。
（2）各组动物均应在同样条件下饲养。
（3）攻击毒原病毒液(100 )注射的小鼠应80%以上死亡。
人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）Renyong Kuangquanbing Yimiao(Vero Xibao)Rabies Vaccine for Human Use（Vero Cell）本品系用狂犬病病毒固定毒接种Vero细胞，经培养、收获、浓缩病、病毒灭活、纯化后，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。
人体狂犬疫苗说明书
人体狂犬疫苗说明书药品名称]通用名：人用狂犬病疫苗（Vero细胞）英文名称：RabiesVaccineforHumanUse（Verocell）汉语拼音：RenyongKuangquanbingYimiao（VeroXibao）通用名：冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）英文名称：RabiesVaccineforHumanUse（Verocell），Freeze-dried 汉语拼音：DongganRenyongKuangquanbingYimiao（VeroXibao）[成分和性状]本品系用狂犬病病毒（L巴斯德固定毒PV2061毒株）接种Vero细胞培养后，收获病毒液，经浓缩、灭活、纯化，并加入适量的人白蛋白制成。
1免疫剂量即为在有效期内其保护效价等于或高于2.5个国际单位（IU）。
本品为无佐剂疫苗，呈无色澄明液体。
本品系用狂犬病病毒(L巴斯德固定毒PV2061毒株)接种Vero细胞养后，收获病毒液，经浓缩、灭活、纯化，并加入适量的人血白蛋白、右旋糖酐制成。
1免疫剂量即为在有效期内其保护效价等于或高于2.5个国际单位(IU)。
本品为白色疏松体，加稀释液溶解后为澄明液体。
稀释液为无色、澄清溶液。
[接种对象]暴露前：本疫苗用于预防狂犬病，推荐下列人员按照暴露前免疫程序接种：所有暴露于持续危险的工作着：如狂犬病病毒诊断、研究的工作者，应进行免疫接种；建议每6个月进行一次血清学检测，当血清抗体滴度低于公认的保护水平（0.5IU/ml）时，应接种加强针。
凡有接触狂犬病病毒危险的人员：如兽医、动物饲养员、林业从业人员、屠宰厂工人、洞穴居住者、动物聚居区的儿童、成人和旅游者等应进行免疫接种。
暴露后：凡被患有或可疑患有狂犬病的动物咬伤、抓伤后，应立即按暴露后程序免疫接种。
[作用与用途]接种本疫苗后，可刺激机体产生抗狂犬病病毒免疫力，用于预防狂犬病。
[规格]水针：每盒内装5支疫苗，0.5ml/支，1剂量/支。
冻干：每盒内装5支冻干疫苗和5支0.5ml稀释液。
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狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）[导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者）（1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179）（2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015）【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。
方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。
另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。
结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。
结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。
免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。
【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author)1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 1101792. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain.【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。
狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。
在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。
《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。
但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。
细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。
1.材料和方法1.1 病毒及细胞病毒株狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。
细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。
1.2 实验动物昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.3 主要试剂FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。
1.4 蚀斑法1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。
1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。
统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。
PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量1.5 免疫荧光法1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。
1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。
正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。
1.6 小鼠LD50测定法将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。
连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
2.结果12份病毒液样品分别用蚀斑法、免疫荧光法及小鼠脑内滴定法测定病毒滴度，结果见表1。
蚀斑法、免疫荧光法分别与小鼠法进行比较，均显示差异无统计学意义（P值分别为0.154，0.699，均为P＞0.05），相关系数为0.646，0.859，说明蚀斑法和免疫荧光法的检测结果与小鼠LD50法呈良好的正相关性。
重复性实验，同一份病毒样本分别用蚀斑法和免疫荧光法检测6次，结果见表2。
蚀斑法测得的lgPFU/ml值的范围为6.62～7.11，变异系数为2.41%；免疫荧光法测得的lgFFU/ml值的范围为6.69～7.00，变异系数为1.69%。
说明免疫荧光法有更好的重复性，精密度更高。
3.讨论国内狂犬病毒的毒力测定一直沿用小鼠LD50法，随着越来越多的人关注动物保护和动物福利等问题，细胞替代法将成为一个必然趋势。
细胞培养条件相对比较好控制，不同批次的细胞均来源于同一株细胞，重复性较好，检测时间也相对较短。
WHO推荐的实验室诊断方法为免疫荧光法，可精确计数被病毒感染的细胞个数，此法敏感且特异性好。
目前，国内也已经开始采用免疫荧光法控制狂犬病疫苗的生产过程[3-5]。
蚀斑法，从理论上讲，一个蚀斑是由一个病毒颗粒感染一个易感细胞形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆，因此，以蚀斑法对毒力强弱的评价较直观、客观性强。
目前这两种方法均被广泛用于狂犬病毒感染的诊断。
实验验证蚀斑法和免疫荧光法与小鼠LD50法检测结果均呈良好的正相关性，可应用于狂犬病毒株PV-2061病毒滴度的检测。
重复性实验显示免疫荧光法的精密度更好，值得推广用于狂犬病毒感染性滴度的检测。
【参考文献】[1]路明霞，殷大鹏．世界卫生组织关于狂犬病疫苗的意见书[J]．中国疫苗和免疫,2008,14(2):187-188．[2]戴华生.新实验病毒学.病毒的滴定及其应用.第1版.北京:中国学术出版社，1983.[3]杨屹，汝东宇，郭秀侠，等.应用篮式生物反应器制备Vero细胞人用狂犬病疫苗[J].中国生物制品学杂志,2011，24（5）:583-585，589.[4] Hassanzadeh SM，Zavareh A，Shokrgozar MA，et al. High vero cell density and rabies virus proliferation on fibracel disks versus cytodex-1 in spinner flask[J].Pak J Biol Sci，2011，14（7）:441-448.[5] Guo CP，Wang CH，Luo S，et al. The adaptation of a CTN-1 rabies virus strain to high-titered growth in chick embryo cells for vaccine development[J].Virol J，2014，11（1）:85-92.。