病毒滴度测定
病毒TCID50测定
病毒TCID50测定病毒TCID50测定是一种常见的病毒滴度测定方法。
下面将介绍具体的操作步骤。
首先，需要准备好细胞。
取出一块细胞培养板，每个孔铺成单层大约60％丰度即可接种病毒。
对照选取16个孔即可。
注意不要窜孔，保证实验条件一致。
其次，稀释待测病毒液。
可以采用A法或B法。
在A法中，向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液，依次10倍系列稀释至适宜浓度。
在B法中，可以根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数，并根据接种的孔数稀释病毒。
接下来，进行接种。
用多道加样器吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液。
将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。
切记要设置正常的细胞对照，每次实验要重复4次，计算标准差。
最后，进行培养。
37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液，加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养。
实验方法将待检病毒接种于细胞培养物中，培养时间为5天，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。
测定结果取出培养板，使用显微镜观察细胞病变情况。
根据病变程度，计算出病毒的浓度。
计算方法1) ___-Karber法利用病变程度计算出病毒的50%细胞传染量（CCID50），计算公式为：LgCCID50/0.2ml= -（X-d/2 + d×∑R1/N1）,其中X代表全部病变最低稀释度对数，d代表稀释因数对数，N1代表每个稀释度所种的孔数，R1代表病变孔数，∑代表积和。
2) Reed-Muench法观察细胞病变情况，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，按照Reed和Muench公式计算出该病毒液的50%细胞传染量（TCID50）。
根据实验结果，能使50%细胞感染的病毒稀释度在10^-4~10^-5之间，根据Reed和Muench公式计算出TCID50.。
病毒滴度测定知识讲解
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
病毒滴度的测定
病毒滴度的测定◆病毒感染的测量方法–直接计数法将病毒与乳胶颗粒混合,电子显微镜观测缺点是无法判断病毒的感染性–间接计数法空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)50%终点法血凝试验干扰滴定第一节空斑形成单位法一、基本原理◆原理–空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)试验：将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒引起，计数空斑数目再乘稀释倍数，得病毒感染的浓度–病毒空斑—蚀斑将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中，吸附1h后，覆盖营养琼脂病毒在琼脂中只感染临近的细胞，形成空斑的退化细胞区中性红染色：活细胞染红色；死细胞无色产生CPU的病毒均可用此方法二、方法与步骤◆测定病毒空斑的试验方法–病毒杀死感染细胞的检测：产生细胞病变效应中型红：活细胞染红色台盼兰：死细胞染蓝色M TT：溴化二苯基四氮唑，将活细胞染成深蓝色，易于计数，易分离病毒转化或有抵抗力的细胞–未能杀死细胞可产生血凝素因能吸附红细胞，空斑用血吸附显出用显微镜计数吸附红细胞的空斑–细胞融合：病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞，用显微镜观查合胞体空斑–空斑中含有病毒的抗原免疫荧光分析–免疫组化技术生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术间接免疫过氧化物酶染色三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算◆空斑形成单位试验技术–传代细胞平皿法单层细胞浓度为2×106，培养液为RPMI1640，Eagle，MEM病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释，每个稀释度培养2瓶，每加一次样时要新吸管，来回吸三次，加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾斜来回摇动，使病毒均匀C O2孵箱吸附90min后，再用营养琼脂覆盖培养5~8d后，加入0.01%的中性红染色，计数空斑◆病毒滴度的计数–按以下公式计算空斑形成单位(PFUs/ml) = d vn n ∙∙X +X +X 21 X1、X2、Xn ：表示同一稀释度在不同培养孔板（实验单位）中数得到的空斑数；n 表示计数空斑的培养板孔数；v 表示病毒量（ml ）；d 表示稀释倍数例：以稀释成10-4的病毒悬液感染细胞，四个培养板孔中的空斑数分别为1，1，3及5个，接种量为0.2 ml空斑形成单位(PFUs/ml) = 4100.245311⨯⨯+++ = 1.25×105PFUs/ml ◆ 空斑形成单位（PFUs ）与重复感染数（M.O.I ）– 重复感染数（Mutiplicity of Infection ，M.O.I ）是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数– 一般来说， M.O.I 值越大，则实验细胞被感染的比例越大– 若某病毒的PFUs 已经测得，要按一定量的M.0.I 进行感染细胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算公式1：实验细胞数×所需的M.O.I 值=所需的PFUs公式2：所需的PFUs/实际病毒的PFUs=需要加的病毒量例：已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml ，试验细胞数为每孔1.8×106，计划M.O.I 值为200。
病毒滴度测定
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
病毒滴度
二、空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
三、50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法（一）细胞准备：1．收集一瓶细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
（二）准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
测定病毒滴度的方法
测定病毒滴度的方法Protocol:1) 转导前一天（第 1 天），胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到 6 孔板中，能使转染当天的融合度达到 30%-50%。
放置 37℃、 5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养。
例如：如果用HT1080细胞测定滴度，通常一个六孔版的孔接种 2×105 个细胞；2) 转导当天（第 2 天），融解病毒，准备 10 倍稀释系列样品，稀释倍数从 10-2到10-6。
对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积 1mL 。
避免漩涡震荡；3) 去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。
另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组。
注：每孔加入的培养液的体积应为 1mL ；4) （可选）在含有病毒的培养液中加入聚凝胺，促进病毒感染细胞。
轻轻地摇晃培养板以混匀聚凝胺。
放置 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱过夜培养；注：一般 polybrene 的储液浓度是 6mg/ml （用超纯水配制，－20 度储存，注意分装，反复冻融三次以上将大大降低效果）。
工作浓度是 6ug/ml 。
5) 转染后一天（第 3 天），去除含有病毒的培养液，加入 2mL 新鲜的完全培养液。
放置 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱过夜培养；6) 转染后两天（第 4 天），去除培养液，加入含有适当浓度的嘌呤霉素的完全培养液以筛选稳定转导的细胞；7) 每 3 天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液；8) 筛选数天后，可以看到对照组没有活细胞，而添加过病毒的 1 个或者更多个的孔会出现药物抗性的克隆。
去除培养液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
注：筛选所需天数应以对照组的所有细胞死亡为准；9) 先加入95%甲醇固定10min,再 加入结晶紫染色液（6 孔板每孔 1mL ）并放置室温孵育10 分钟；10) 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次；11) 计数被染成蓝色的克隆数目，并计算病毒滴度。
慢病毒滴度检测——ELISA法VS qPCR法
慢病毒滴度检测——ELISA法VS qPCR法
慢病毒滴度检测是检验慢病毒是否合格的方法之一。
在一些特定的实验中，我们需要为病毒的浓度，即滴度，进行测定。
由于慢病毒载体的不同以及客户需求的不同，有的慢病毒会带有荧光标记，而有的没有，故而滴度检测也有不同的方法。
一、ELISA法
传统的p24 ELISA可检测到293细胞在瞬时转染过程中产生的病毒相关p24和游离p24，而游离的p24可以占上清液中p24总量的很大一部分。
因此，传统的p24 ELISA通常会高估存在的慢病毒的数量。
新的QuickTiter慢病毒滴度试剂盒（与慢病毒相关的HIV p24）可最大程度地减少此问题。
一项专有技术可在运行测定的ELISA部分之前，将慢病毒与溶液中的游离p24分离。
二、Real-time PCR法
GeneCopoeia的Lenti-Pac 慢病毒滴度检测试剂盒系列产品为简便、快速检测慢病毒颗粒的滴度而设计。
试剂盒包含从RNA抽提到qRT- PCR检测过程的全套试剂，样品经过RNA抽提、DNase消化、反转录、qRT-PCR步骤即可确定慢病毒滴度。
特点：
1.能够判断慢病毒是否包装成功；
2.准确测定病毒拷贝数，以确保细胞转导和基因表达的效率；
3.提供滴度检测过程从病毒的RNA提取到qPCR检测所需要的试剂。
综上，慢病毒滴度检测：ELISA法结合qPCR法，想怎么测就怎么测~
文章来源：武汉艾美捷科技。
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病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3． PFU（空斑形成单位）4． TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。
迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。
对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。
所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。
下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。
选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。
无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。
一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：106~107 第一代细胞经冻融后108~109 100倍数量的细胞经过冻融后1010~1011 用氯化铯方法纯化后表6：各滴度测定方法特性方法类型时间可重复性滴度* 评注VP 物理学方法 2小时好 5×1012GTU 生物学方法 2天可变 2×1011PFU 生物学方法 21天变化很大 5×1010 传统方法TCID50 生物学方法 10天可变 2.5×1011 昆腾公司标准方法以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml）这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。
相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。
由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果 OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。
这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。
同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。
1． 4℃融化病毒保存液。
2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。
最小需要量为： s病毒裂解液病毒稀释度52ul 52ul 1：2（稀释液1）168ul 42ul 1：5（稀释液2）注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD 值在0.1~1.0之间。
3． 56℃震荡培养10分钟。
0 uf'gbjf4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。
5．测定260nm处吸光值：稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。
稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。
测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。
例如1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。
2．记下空白管读数后弃去，不要冲洗。
3．加入450ulVLB和50ul 1：5稀释样本（稀释液2），组成稀释液5。
4．记下读数后弃去。
5．清洗比色杯，加入样本重复测一次。
6．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：5稀释空白液。
7．记下空白管读数后弃去，不要清洗。
8．加入400ul VLB和100ul 1：5稀释样本，组成稀释液4。
9．记下读数后弃去。
10．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：2稀释空白液。
11．记下空白读数后弃去，不要清洗。
12．加入400ul VLB和100ul 1：2稀释样本，组成稀释液3。
13．记下读数后弃去。
将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012= OPU/ml5.8.2 空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。
由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。
1． 5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5． 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
5.8.3 50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。
5.8.3.1 细胞准备：1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
5.8.3.2 准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
第1管中再加入0.1ml病毒保存液。
2．上下吸打5次混匀。
3．换用新枪头。
4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
5．反复稀释至最高稀释度。
6．用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。
7．最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。
阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。
加样时从最高稀释度开始。
8． 37℃培养10天。
9． 10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。
只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。
10．计算每一排中出现阳性的孔数。
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。
图7：TCID50的典型结果稀释度孔对照稀释度比率 3v q- / 210-10 0/10=0 uc% ?\0jo#10-9 0/10=0 F78?54dN]210-8 2/10=0.2 ' 7]<Qo ¬g10-7 6/10=0.6 HG1gai 7Z#10-6 10/10=1 |_?1%0rv>10-5 10/10=1 oQ = | d,10-4 10/10=1 iE +F ' 510-3 10/10=1 D 8| *gu&o在这一例子中，当稀释度为10-6时出现100%阳性，当稀释为10-9时出现0%阳性。
因此，滴度可以用KARBER统计法精确算出：对于100ul的稀释液，滴度为T=101+d（s-0.5）d=log10稀释度=1（对于10倍的稀释度而言）s=阳性比率之和（从第1个10倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。
虽然一些低稀释度在测定中省略了（如10-1和10-2），但在计算时仍应以阳性比率为1来算。
滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul病毒保存液中）T=100.3≈2×108 TCID50/ml。
说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。
将TCID50/ml转换为PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。
两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。