手性醇脱氢酶与甲酸脱氢酶的融合蛋白体系的构建_吴希

第60卷　第10期 化　工　学　报 V ol .60　N o .10　2009年10月 CIESC Jour nal Oc to be r 2009研究简报手性醇脱氢酶与甲酸脱氢酶的融合蛋白体系的构建吴　希,张　翀,邢新会(清华大学化学工程系,北京100084)关键词:融合蛋白;辅酶再生;手性醇脱氢酶;甲酸脱氢酶;麦芽糖结合蛋白中图分类号:Q 81 文献标识码:A文章编号:0438-1157(2009)10-2562-06Construction o f fusion protein systems consisting of a chiralalcohol dehy drogenase and a fo rmate dehydrogenaseW U Xi ,ZH ANG Chong ,XING Xinhui(Department of Chemical Engineering ,Tsinghua University ,Bei jing 100084,China )Abstract :The bifunctional fusio n protein system s consisting of Rhodococcus ery thropolis chiral alco ho l dehy dro genase (READH ),Candida boid inii fo rmate dehy drog enase (CbFDH )o r maltose binding protein (MBP )w ere co nstructed to regenerate the cofactors fo r bio cataly sis .READH originated fro m Rhodococcusery thropolis is an (S )-specific nicotinamide adenine dinucleotide (NADH )-dependent alco ho l dehy dro genase ,meanw hile ,CbFDH o riginated from Cand ida boidinii is an NADH -dependent form ate dehy dro genase .The strategies of the diffe rent fusion pro tein sy stems included :(1)fusion of the N terminus of REA DH to the C terminus of MBP ,(2)fusion of the N terminus of CbFDH to the C terminus of M BP ,(3)fusion o f the N terminus of READH to the C terminus o f CbFDH ,(4)fusion of the C terminus of READH to the N terminus of CbFDH .The activities o f READH s w ere depressed in all fusion strategies .When the N terminus of READH w as fused to the C terminus of CbFDH ,READH reached the hig hest activity ,but CbFDH had no activity .In co ntrast ,w hen the C terminus of READH w as fused to the N terminus of CbFDH ,CbFDH show ed the highest activity ,and both m oieties displayed activities .From this study ,the autho rs sugg est that the rational desig n of the bifunctional fusio n protein sy stem m ay improve the bioca talysis efficiency by the sim ultaneous cofacto r regeneration .Key w o rds :fusion protein ;cofactor regeneration ;chiral alcohol dehydrogenase ;form ate dehydrogenase ;maltose binding pro tein 2009-02-26收到初稿,2009-07-02收到修改稿。

联系人:邢新会。

第一作者:吴希(1988—),女,博士研究生。

基金项目:国家自然科学基金项目(20836004)。

引　言手性芳基醇是一种重要的手性化合物,在液晶、药物、香料和农用化学品的生产中具有重要的应用[1]。

在手性芳基醇的生产方法中,生物法具有 Received date :2009-02-26.Corresponding autho r :P rof .XING Xinhui ,x hxing @tsingh ua .edu .cnFoundation item :su pported by th e National Natu ral S cience Foundation of China (20836004).反应条件温和、反应步骤少等优势,且该方法具有很强的立体、区位和对映选择性[2]。

通过氧化还原酶进行生物转化的理论收率可以达到100%,目前越来越受到人们的重视[3]。

但是,在氧化还原酶的应用中,除了需要合适的酶外,还需要提供高效、低成本的辅酶再生系统[4]。

辅酶的生物法再生通常包括酶耦联法和底物耦联法,其中酶耦联法是利用两个平行的氧化还原反应酶系统,一个酶催化底物转化,另一个酶则催化辅酶循环再生[5]。

在传统的酶耦联法再生体系中,需要分别添加底物催化酶和辅酶循环酶两种酶,操作麻烦,成本高,且辅酶在两个酶分子间传递,有可能造成辅酶再生效率不高。

利用融合策略构建人工酶有可能使两个酶的活性位点接近,从而提高催化效率[6]。

Daniel 等[7]的最新研究表明,通过构建Baey er -Villiger 单加氧酶-亚磷酸脱氢酶融合蛋白体系,以亚磷酸盐为电子供体,在一个融合酶内实现了催化及辅酶尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(nicotinamide adenine dinucleo tide pho sphate ,NADPH )再生的双重功能。

但是,到目前为止,尚未报道基于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nico tinamide adenine dinu -cleotide ,NADH )再生的融合酶实现催化与再生双重功能。

READH [(S )-specific NADH -dependent alcohol dehydrogenase ]是来源于红平红球菌Rhodococcus ery thropolis 的依赖于NADH 的S 型醇脱氢酶,可以催化苯乙酮生成(S )-1-苯乙醇(苯乙酮+NADHREADH(S )-1-苯乙醇+NAD +);源于博伊丁假丝酵母Candida boidinii的CbFDH (NADH -dependent fo rmate dehydro -g enase )是依赖于NAD +的甲酸脱氢酶,可以用于还原型辅酶NADH 的再生(甲酸+N AD +CbFDHCO 2+NADH );麦芽糖结合蛋白(maltose binding pro tein ,M BP )可以帮助蛋白的可溶性表达[8-9],并且与REA DH 及CbFDH 的蛋白大小相近(READH 的理论大小为36.0×103[10],CbFDH 的理论大小为40.6×103[11],M BP 的理论大小为42.5×103[12])。

因此,选择READH 、CbFDH 及MBP ,研究其相互间的融合策略对拓展融合蛋白技术的用途具有重要的探索价值。

本文将构建并比较不同的READH 与CbFDH 的双酶融合蛋白体系(图1),主要包括:(1)READH 的N端与MBP 的C 端融合;(2)CbFDH 的N 端与MBP 的C 端融合;(3)READH 的N 端与CbFDH 的C 端融合;(4)READH 的C 端与CbFDH 的N 端融合,研究不同的融合策略对READH 与CbFDH 活性的影响,并探讨融合策略影响酶活性的主要因素。

图1　融合蛋白催化再生N A DH 转化苯乙酮为(S )-1-苯乙醇概念图Fig .1　Conver sio n from aceto pheno ne to phenylethano l cataly zed by fusion pro tein w ith N A DH regenera tion1　实验材料和方法1.1　质粒和菌株及引物E .coli Top10F ′、E .coli TB1为宿主菌,购自Invitrogen 公司,pMA L -c2X 购自Invitro gen 公司。

pMD -readh ,pCbFDH1本实验室保藏。

表1列出了实验用菌株及质粒。

1.2　重组质粒pM A L -c2X -readh 与pMA L -c2X -cbfdh 的构建 以pMD -readh 为模板,以P1F 、P2R 为引物,PC R 扩增readh 基因;以pCbFDH1为模板,以P3F 、P4R 为引物,PCR 扩增cbfdh 基因。

对PC R 的扩增产物及质粒pMA L -c2X 进行EcoRI 以及Bam H I 双酶切,连接。

构建得到的质粒分别命名为pMA L -c2X -readh 和pM AL -c2X -cbfdh ,分别用于表达READH 的N 端与M BP 的C 端融合的融合蛋白M BP -READH 及CbFDH 的N 端与M BP 的C 端融合的融合蛋白M BP -CbFDH 。

1.3　重组质粒pM A L -c2X -readh -cbfdh 及pM AL -c2X -cbfdh -readh 的构建 以pCbFDH 1为模板,以P5F 、P6R 为引物,PC R 扩增cbfdh 基因;以pM D -readh 为模板,以P7F 、P8R 为引物,PCR 扩增readh 基因。

对PC R 扩增的cbfdh 基因及质粒pM A L -c2X -readh 进行NdeI 以及SacI 双酶切,连接,构建得到的质粒命名为pM AL -c2X -readh -cbfdh ,用于表达READH 的N 端与CbFDH 的C 端融合的融合蛋白CbFDH -READH 。