太湖反硝化_硝化_亚硝化及氨化细菌分布及其作用

应用与环境生物学报　1998,5(2):190～194 Chin.J.Appl.Environ.Biol.　1998204225太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用3王国祥　濮培民　黄宜凯　张圣照(中国科学院南京地理与湖泊研究所　南京　210008)摘　要　用最大可能数(MPN:M ost2Probable2Number)法,测定了太湖五里湖敞水区及各种生态类型水生高等植物群落内的反硝化、硝化、亚硝化和氨化细菌的分布,并分析探讨了它们的作用.结果表明,反硝化细菌的最大可能数[n(MPN)],在水生高等植物群落内水体中较敞水区湖水高2～5个数量级,差异极显著(P<0.01),漂浮植物群落内水体的反硝化细菌n(MPN)较沉水和浮叶植物群落内水体高2～3个数量级,差异极显著(P<0.01);硝化细菌n(MPN),敞水区湖水高于凤眼莲、水花生群落内水体,差异显著(P<0.05),菱群落与其他群落比较,亦有极显著性差异(P<0.01);亚硝化细菌n(MPN),在水生高等植物群落内的水体中较敞水区高3～4个数量级,差异极显著(P<0.01);氨化细菌n(MPN),在水生高等植物群落内的水体中高于敞水区水体.除硝化细菌外,反硝化、亚硝化及氨化细菌均在根际处最为密集,且由根际向外呈现递减趋势.各种水生高等植物群落内氮循环细菌分布及微环境的差异,促进了有机氮的分解、铵态氮的硝化和挥发、硝酸盐氮的反硝化作用.室内培养试验结果表明,水生高等植物生长区水样的氨化产气量为敞水区的2倍左右,凤眼莲、水花生覆盖下的水样反硝化产气量分别为敞水区的6.2和4.8倍,表明有水生高等植物生长的水体,氮素容易释放进入大气.关键词　反硝化细菌;硝化细菌;亚硝化细菌;氨化细菌;太湖中图法分类号　Q939.108¬Q178.513DISTRIBUTION AN D ROL E OF DENITRIFYING,NITRIFYING,NITROSATION AN D AMMONIFYINGBACTERIA IN THE TAIHU LAKEW ANG G uoxiang,PU Peimin,H UANG Y ikai&ZH ANG Shengzhao(Nanjing Institute o f G eography&Limnology,the Chinese Academy o f Sciences,Nanjing　210008)Abstract　The distribution and role of four nitrogen cycle bacteria,including amm onifying bacteria,denitri2fying bacteria,nitrobacteria and nitros obacteria,were determined with MPN method in the T aihu Lake.Them ost probable number[n(MPN)]of denitrifying bacteria in the water covered by Alternanthera philoxeroidesand Eichhornia crassipes are about2～3and2～5order2of2magnitudes higher than those in the water vegetatedwith other macrophytes and in the unvegetated water,respectively.There is a significant difference betweenthem(P<0.01).The n(MPN)of amm onifying bacteria in vegetated water are markedly higher than those inthe unvegetated water.The n(MPN)of nitros obacteria in the vegetated water are notably higher than those inthe unvegetated water(P<0.01).The n(MPN)of nitrobacteria and nitros obacteria in the water vegetatedwith submerged plants are higher than those in the water covered by floating plants.The n(MPN)of amm onify2ing and denitrifying bacteria,nitros obacteria are very dense in rhizosphere and present a decreasing tendencyfrom root sur face to outside.The results dem onstrate that the differences in distribution of the four nitrogen bac2收稿日期:1998202227 接受日期:19982042283中国国家科委和欧洲联盟科技部支持项目　Physic2biological engineering for rem oving algae and purifying water quality in Lake T ai2 hu,China,合同号CI132CT9320094(DG12HS M U)teria am ong the different aquatic macrophytes play a significant role in nitrogen rem oval.The results of cultureexperiment show that the v olume of the gas produced by amm onification in the vagetated water is about 2timesas much as that in the unvegetated open water.The v olumes of the gas produced by deitrification in the watercovered by water peanut and hyacinth are 6.2and 4.8times as much as those in the unvegetated water.I t indi 2cates that nitrogen is liable to emit to atm osphere from the vegetated water.K eyw ords denitrifying bacteria ;nitrobacteria ;nitros obacteria ;amm onifying bacteria ;T aihu Lake氮循环过程包括生物固氮、氨化、硝化、反硝化及同化等作用,其中生物固氮、氨化、硝化及反硝化是微生物的特有过程[1～3].对稻田氮循环研究表明:由硝化2反硝化细菌所引起的硝化2反硝化作用是土壤、湿地中氮素损失的重要机制之一[4～6],氮肥施入稻田后其氮素损失可达30%～75%,而且大部分氮素以分子态形式进入大气.在湿地研究中,国外提出了根区法,认为根际微生物在湿地植物根际的氧化2还原微环境中,进行着硝化2反硝化作用,促进了湿地氮素释放[7,8].对湖泊生态系统中氮循环细菌分布,国外有一些报道[1～4,9],国内尚未见报道.本项研究结果表明,水生高等植物覆盖区内的氨化和反硝化细菌密度明显高于无植物覆盖的敞水区;附着于水生高等植物根际的氨化细菌将水中的有机氮转化为无机氮(其中大部分转化为气态的氨气直接进入大气);同时,反硝化细菌将无机氮盐(NO -32N 及NO -22N )还原为气态的N 2O 及N 2,并释放到大气中,从而削减了水体中的氮负荷,这对于富营养化湖泊的净化具有特别重要的积极意义.1　实验部分1.1　样品采集及样品处理在太湖无锡中桥湖湾的湖面敞水区和各种水生高等植物生长区,按标准方法[10]直接采集细菌水样;并同时在凤眼莲根系外10cm 、30cm 处用无菌针筒采集细菌水样,取样深度为水面下20cm.采集凤眼莲根样,经实验室无菌处理[11],分别获得根际菌和根面菌的菌悬液,与水样同法测氮循环细菌数量.1.2　氮循环细菌的n (MPN )测定用最大可能数(MPN :M ost 2Probable 2Number )法测定水样中硝化、亚硝化、氨化及反硝化细菌的数量n (MPN )[11～13].分别配制硝化、亚硝化、氨化及反硝化细菌培养基[12,13],调节pH 值,分装于l 150mm ×d i 14mm 的试管中,并将l 30mm ×d i 5mm 的小指管分别倒置于装有氨化和反硝化细菌培养基的每支试管内,加塞,在121℃下灭菌20min.每个水样作3～4个10倍系列稀释,每支试管中接种水样和稀释水样各1m L ,每一稀释度做5个平行.在(28±1)℃条件下,氨化细菌、反硝化细菌培养15d ,硝化和亚硝化细菌培养30d.以红石蕊试纸、纳氏试剂、格里斯(G riess )试剂、二苯胺试剂、醋酸2硫酸亚铁试剂等检测各种形态氮的产生和消失情况,定期观测发酵管内发酵、产气情况[12,13].查MPN 表[10],用下式计算样品中的细菌数量n (MPN )/L -1.n (MPN )=MPN 指数×[10(m L )÷接种量最大的一管样品量(m L )]根样及根表附着物样,亦用上式计算样品鲜重(m FW )的n (MPN ),单位:kg -1.在比较水样、根样及根表附着物(根际)样n (MPN )时,视1L 水为1kg.1.3　氨化和反硝化强度的测定在用MPN 法定量测定水体氮循环细菌数量的同时,用l 200mm ×d i 30mm 的大试管(内倒置5.0m L 的离心管),分别盛50m L 氨化、反硝化细菌培养基,各设5个平行,分别测氨化、反硝化强度.培养基分装后,同MPN 法灭菌,每管接种原水样5m L ,同样条件培养15d ,记录离心管内截留的气体量.2　实验结果2.1　敞水区和水生高等植物群落内氮循环细菌数量分布的比较由图1、表1可见,反硝化细菌n (MPN ),在水生高等植物群落内水体中明显高于无水生高等植物覆盖的1912期王国祥等:太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用 敞水区湖水,平均高2～5个数量级.Q 检验结果表明,各种水生高等植物群落内反硝化细菌最大可能数与敞水区比较均有极显著性差异(P <0.01).由图2、表1可见,硝化细菌n (MPN ),在敞水区略高于凤眼莲、水花生及荇菜群落内,但除凤眼莲、水花生群落内与敞水区的湖水硝化细菌n (MPN )有显著性差异(P <0.05)外,其余均无显著性差异(P >0.05).表1　各种水生高等植物群落内外氮循环细菌最大可能数[n (MPN )]的几何均值T able 1　The geometric means of n (MPN )of nitrogen cycle bacteria inside and outside macrophyte communities菱(T )33凤眼莲(E )33水花生(A )33荇菜(Ny )3伊乐藻3(E l )33轮叶黑藻3(Hy )33敞水区(ow )33反硝化菌(db ) 3.99×1048.44×106 2.18×107 4.94×105 2.50×105 2.50×104 2.61×102硝化菌(nb ) 2.92×104 1.48×102 1.61×1028.07×1029.00×103 1.70×104 3.08×103亚硝化菌(nob ) 4.25×1067.57×105 2.11×105 4.60×1059.00×106 4.60×106 1.68×102氨化菌(ab ) 2.62×105 1.30×105 1.40×1059.94×104 1.40×103 1.40×103 4.28×1033仅1次测定值,不参与方差分析 Only one n (MPN )determ ination ,not used in analysis of variance.33T:Trapa sp ,E:Eichhornia crassipes ,A :Alternanthera philoxeroides ,Ny :Nymphoides peltata ,E l :Elodea nuttallii ,Hy :Hydrilla verticillata ,ow :open water ;db :denitrifying bacteria ,nb :nitrifying bacteria ,nob :nitrosation bacteria ,ab :am 2m onifying bacteria (下同The same below )图1　不同水生高等植物群落内反硝化细菌分布Fig.1　Distribution of denitrifying bacteria in different macrophytes 图2　同水生高等植物群落内硝化细菌分布Fig.2　Distribution of nitrobacteria in different macrophytes 由图3、表1可见,亚硝化细菌n (MPN ),在水生高等植物群落内水体中比敞水区湖水高3～4个数量级.各种水生高等植物群落内亚硝化细菌n (MPN )与敞水区比较均有极显著性差异(P <0.01).由图4、表1可见,菱、凤眼莲、水花生及荇菜群落内氨化细菌n (MPN )略高于敞水区,但差异性并不显著(P >0.05).图3　不同水生高等植物群落内亚硝化细菌分布Fig.3　Distribution of nitros obacteria in different macrophytes 图4　不同水生高等植物群落内氨化细菌分布Fig.4　Distribution of amm onifying bacteria in different macrophytes2.2　不同生态类型水生高等植物群落内水体氮循环细菌分布的比较由图1、表1可见,漂浮植物凤眼莲和水花生群落内水体反硝化细菌n (MPN )高于沉水植物菱、伊乐藻、轮叶黑藻,2～3个数量级.Q 检验结果表明,凤眼莲与水花生、菱与荇菜的反硝化细菌n (MPN )均无显著性差异(P >0.05);而凤眼莲与菱及荇菜、水花生与菱及荇菜的反硝化细菌n (MPN )均有极显著性差异(P <0.01).由图2、表1可见,在菱沉水植物(轮叶黑藻和伊乐藻)群落中,水体硝化细菌n (MPN )较高,Q 检验结果表明,菱与凤眼莲、水花生及荇菜群落内的水体硝化细菌n (MPN )比较均有显著性差异(P <0.01),而其余群落之间无显著差异(P >0.05).由图3、表1可见,亚硝化细菌n (MPN ),除在菱与水花生群落内的水体之间有显著性差异(P <0.05)外,291 应用与环境生物学报 5卷在其余群落内的水体之间均无显著性差异(P >0.05).Q 检验结果还表明,各群落内的水体之间,氨化细菌n (MPN )均无显著性差异(P >0.05).2.3　水生高等植物根际氮循环细菌的梯度分布 由图5可见,凤眼莲根系絮状附着物(根际)的氨化、反硝化及亚硝化细菌n (MPN )均高于根表面及远离群落根际的区域,尤其是根际反硝化细菌的n (MPN )较根表面高4个数量级、较根外10cm 和30cm 处的水体分别高2和5个数量级;根际氨化、亚硝化细菌较根表面分别高3和2个数量级,较根外的两点亦分别高2～3个数量级.2.4　氨化和反硝化作用产气量在测定敞水区、凤眼莲、水花生及菱群落内水体氨化和反硝化细菌n (MPN )的同时,还测定了各样品氨化图5　凤眼莲根际周围氮循环细菌分布Fig.5　Distribution of nitrogen cycle bacteria aroundthe root of Eichhornia crassipesrs :根面root surface ,rh :根际rhiz osphereor :根外outside of root (见表1See T able 1)和反硝化产气量(表2)及主要气体类别.纳氏法测定结果表明,氨化作用产生的气体主要是NH 3;气相色谱分析结果表明,反硝化作用产生的气体主要是N 2O. 统计分析结果表明,样品氨化、反硝化细菌的最大可能数之对数与产气量的相关系数分别为0.866、0.873;显著性检验结果:t 值分别为10.038、25.938,均大于t (0.001,10)=4.587,表明样品氨化、反硝化细菌的最大可能数之对数与产气量相关性有极显著意义.表2　氨化和反硝化细菌的最大可能数与气体截留量T able 2　The catching gas v olume and n (MPN )of amm onifying and denitrifying bacteria氨化细菌(Amm onifying bacteria )1997206199720819972092x g 反硝化细菌(Denitrifying bacteria )1997206199720819972092x g 33凤眼莲(E )3n (MPN )V /m L 1.7×1041.1 2.5×1052.5 3.5×1052.7 1.1×1052.1 1.7×1072.9 1.8×1062.4 1.6×1083.9 1.7×1073.1水花生(A )3n (MPN )V /m L 9.0×1042.5 3.0×1041.19.0×1052.2 1.3×1051.99.0×1062.5 1.8×1072.1 1.8×1082.6 3.1×1072.4菱(T )3n (MPN )V /m L 1.8×1052.5 1.7×1052.5 1.8×1062.7 3.8×1052.6 3.0×1040.6 6.0×1040.89.0×1050.7 3.1×1050.7敞水区(ow )3n (MPN )V /m L 2.5×1041.2 2.5×1030.9 1.5×1041.1 3.1×1031.19.0×1020.5 1.2×1020.5 1.4×1020.5 3.1×1020.53见表1　See T able 1 332x g :几何平均值G eometric means 由表2可知,氨化作用产气量,菱群落内水样最高,为敞水区水样的2.36倍;凤眼莲、水花生群落内水样的氨化作用产气量分别为敞水区水样的1.91、1.73倍.因此,在水生高等植物群落内,由于氨化细菌较多,环境条件较适宜(pH 7.9～8.8),氨化作用将有机氮还原为铵和氨,促进了湖水中的氮以气态氨的形式挥发.凤眼莲、水花生群落内水样的反硝化产气量分别敞水区的6.2、4.8倍,而菱群落内水样的反硝化产气量仅为敞水区的1.4倍.特别是在凤眼莲、水花生群落内,水体溶解氧较低(0.19～0.90mg/L ),pH (7.5～9.0)等环境条件较适宜,有利于反硝化细菌进行反硝化作用,将水中的NO 232N 还原为NO 222N 及气体N 2O 和N 2,从而促进了湖水氮素释放.3　讨论3.1　水生高等植物与氮循环细菌的分布水生高等植物是水体氮循环细菌的重要载体.反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌是水体及湿地环境中常见的菌群,其生长和繁殖不仅受底物浓度影响,而且受环境条件影响.特别是反硝化与硝化及亚硝化细菌,前者往往分布在厌氧还原环境中,而后两者则通常分布于富氧氧化环境中.在湖泊的敞水区,由于湖水的均质性,因此,这些菌群很难同时形成优势并产生作用.而在水生高等植物根际存在氧化还原微环境,空气中的氧3912期王国祥等:太湖反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌分布及其作用 气通过水生高等植物的根茎叶通气组织到达水生高等植物根部,并扩散到根表面,环绕根形成一薄的氧化层(即根际氧化带aerobic rhizosphere )[4];在这一氧化层外,由于水生高等植物的覆盖及其呼吸代谢作用,往往处于缺氧状态.正是由于在水生高等植物根区存在这样一个富氧-缺氧的氧化还原微环境(图6),因此,反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌能够同时出现并发挥其作用.研究结果表明,反硝化、亚硝化及氨化细菌在水生高等植物群落内的水体中均高于敞水区,而且在植物根际处最为密集.这说明,水生高等植物是水体反硝化、亚硝化及氨化细菌的重要载体.用水生高等植物净化受污水体,由于同时引入了大量的氮循环细菌,并为氨化、硝化2反硝化作用创造了有利条件,从而促进了水体氮循环过程,增强了水体自净功能.图6　水生高等植物根际氧化还原微环境及氮循环Fig.6　The m icroenvironment of oxido 2reduction in theroot z one of aquatic macrophytes and nitrogen cycle (1)氨化作用amm oniation (2)反硝化作用denitrification(3)硝化作用nitrification (4)亚硝化作用nitros ofication 3.2　氮循环细菌分布对氮循环过程的影响在氮循环过程中,反硝化、硝化、亚硝化及氨化作用是微生物的特有环境功能,只有存在这些细菌,才能发生相应的氮循环过程,因此,氮循环细菌的分布对氮循环过程有重要影响.而且,用MPN 法测定氮循环细菌,其依据就是各类氮循环细菌的生理功能.测定水样反硝化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将NO 232N 转化为NO 222N 及产气(N 2O 、N 2)的概率,估算水样中反硝化细菌的n (MPN );测定水样硝化或亚硝化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将NO 222N 或NH +42N 转化为NO 232N 或NO 222N 的概率,估算水样中硝化或亚硝化细菌的n (MPN );测定水样氨化细菌含量就是依据该水样在一定条件下将有机氮转化为铵或氨氮的概率,估算水样中氨化细菌的n (MPN ).因此,用MPN 法测定的水体反硝化、硝化、亚硝化及氨化细菌结果,在某种意义上反映了该水体反硝化、硝化、亚硝化及氨化作用强度.特别是反硝化作用,国内外的研究业已证明,在有水生植物生长的湿地或水体中较无水生植物生长的湿地或水体强烈[6～8,11].本研究结果表明,反硝化细菌在水生高等植物群落内水体中明显高于敞水区湖水,在漂浮植物群落内水体中明显高于沉水和浮叶植物群落内水体;而且漂浮植物群落内的水体,由于受其上群落的覆盖影响,溶解氧较低,处于相对缺氧状态(0.19～0.90mg/L ).研究结果进一步揭示,正是由于水生高等植物群落内存在密集的反硝化细菌及有利的反硝化微环境,所以反硝化作用特别强烈.致谢　感谢中国科学院太湖湖泊生态系统研究站杨龙元研究员给予的大力支持和帮助.参考文献1　Rheinheimer G.Aquatic M icrobiology.3rd ed.New Y ork :John W iley &S ons ,19852　M atulewich VA ,Finstein MS.Distribution of autotrophic nitrifying 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