蛋白不表达：常见原因及分析
质谱分析蛋白表达差异
百泰派克生物科技
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术研究蛋白表达差异。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白表达差异分析服务。
蛋白表达差异
蛋白质是由基因转录后翻译形成的，是生物体中一类重要的生物大分子。
蛋白质除了参与生物体细胞和组织的组成，还可以在生物体中发挥广泛的功能，例如催化代谢反应、参与DNA复制、对刺激（如病原体）作出反应，以及将分子从一个位置运输到另一个位置等等。
蛋白表达差异，指的是蛋白质在表达水平上的变化，它可以发生在细胞在不同功能状态、不同细胞周期，或者是在不同条件或药物刺激等情况下。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质，更有助于帮助我们研究疾病的早期诊断、疾病的病程，和检测药物对疾病的疗效等等。
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术对蛋白表达差异进行研究。
质谱技术通过检测不同样品中蛋白质的差异表达，来实现样品中蛋白表达差异的分析。
借助生物信息学技术，还可以对有表达差异的蛋白进行分析，例如基于质谱数据可以对差异表达的蛋白质进行统计分析，如韦恩图和火山图，通过韦恩图可以看出两个差异样品之间的共有的和特有的差异表达蛋白数量，通过火山图（Volcano Plot）可以查看蛋白在两个不同样品中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。
His-Tag表达蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
荧光蛋白表达不均匀的原因
荧光蛋白表达不均匀的原因
荧光蛋白表达不均匀可能由多种原因引起，以下是一些可能的因素：1. 质粒拷贝数：质粒拷贝数的不均匀分布可能导致荧光蛋白表达的不均匀。
不同细胞可能含有不同数量的质粒，从而导致荧光蛋白表达水平的差异。
2. 转染效率：转染过程中，并非所有细胞都成功摄取质粒并表达荧光蛋白。
转染效率的差异可能导致不同细胞之间荧光蛋白表达的不均匀。
3. 细胞周期：细胞周期的不同阶段可能对荧光蛋白表达产生影响。
例如，在细胞分裂期间，荧光蛋白的表达可能受到抑制，导致表达不均匀。
4. 细胞健康状态：细胞的健康状态可能影响荧光蛋白的表达。
受损或死亡的细胞可能表达较少或不表达荧光蛋白，从而导致不均匀的表达。
5. 培养条件：培养细胞的条件，如营养供应、温度、氧气含量等，也可能对荧光蛋白表达产生影响。
不合适的培养条件可能导致表达不均匀。
6. 荧光蛋白稳定性：某些荧光蛋白可能在细胞内不稳定，容易降解或失活。
这可能导致荧光蛋白表达的不均匀和逐渐消失。
为了解决荧光蛋白表达不均匀的问题，可以尝试以下方法：
1. 优化转染条件：尝试不同的转染方法和试剂，以提高转染效率和均匀性。
2. 细胞筛选：选择转染效率高且荧光蛋白表达均匀的细胞系进行实验。
3. 培养条件优化：确保培养条件稳定，并提供适当的营养和环境。
4. 荧光蛋白选择：选择稳定性较高的荧光蛋白，并进行适当的表达和检测条件优化。
蛋白不表达原因
蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
WB常见问题解答
Western Blot常见问题及处理(一)1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
蛋白不表达常见原因及分析
蛋白不表达常见原因及分析在生物学和医学研究中，蛋白表达是一个至关重要的环节。
然而，经常会遇到蛋白不表达的情况，这给研究工作带来了很大的困扰。
要解决蛋白不表达的问题，首先需要了解导致这一现象的常见原因。
一、基因层面的问题1、基因序列错误基因在转录和翻译过程中，需要遵循严格的碱基互补配对原则。
如果基因序列本身存在错误，比如碱基的缺失、插入或突变，就可能导致 mRNA 无法正确合成，或者合成的 mRNA 无法翻译成有功能的蛋白质。
2、基因调控元件异常基因的表达受到多种调控元件的控制，如启动子、增强子、沉默子等。
如果这些调控元件发生突变或缺失，可能会影响基因的转录起始效率，导致蛋白表达水平降低甚至不表达。
3、基因拷贝数不足在某些情况下，基因的拷贝数过低会导致转录产生的 mRNA 量不足，从而无法合成足够的蛋白质。
二、转录层面的问题1、 RNA 聚合酶活性受影响RNA 聚合酶负责将 DNA 转录为 mRNA，如果其活性受到抑制或者出现功能障碍，就会影响 mRNA 的合成，进而导致蛋白不表达。
2、转录因子异常转录因子能够与基因的调控元件结合，促进或抑制基因的转录。
当转录因子的表达水平、活性或与调控元件的结合能力出现异常时，可能会影响基因的正常转录。
三、翻译层面的问题1、密码子偏好性不同的生物体对某些密码子的使用频率存在差异。
如果在表达系统中使用了不常用的密码子，可能会导致翻译效率低下甚至停滞，从而造成蛋白不表达。
2、 tRNA 丰度不足tRNA 负责携带氨基酸参与蛋白质的合成。
如果某些特定 tRNA 的丰度不足，无法及时供应相应的氨基酸，就会影响蛋白质的翻译进程。
3、核糖体结合位点问题核糖体需要结合在 mRNA 上的特定位点才能启动翻译。
如果核糖体结合位点的序列发生突变或缺失，核糖体无法有效结合，蛋白合成也会受到阻碍。
四、蛋白折叠与修饰问题1、错误折叠即使蛋白质成功合成，若折叠过程出现错误，形成的错误构象可能会被细胞内的质量控制系统识别并降解，导致蛋白无法积累。
蛋白表达常见问题分析
蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。
针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。
对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3．表达条件的优化选择不同的培养基。
对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。
但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。
对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。
裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。
在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。
蛋白不表达
蛋白不表达引言蛋白质是生物体中最基本的组成部分之一，它们在生物体内发挥着重要的功能。
然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会出现问题，导致一系列的生物学和医学问题。
本文将探讨蛋白质不表达的原因、影响以及可能的解决方法。
为什么蛋白不表达蛋白质的表达受到多种因素的调控，包括基因转录、蛋白翻译、蛋白质修饰等。
蛋白质不表达的原因可以是多方面的。
1. 基因转录问题基因转录是蛋白质表达的第一步，如果基因没有被正确地转录成mRNA，则无法进行后续的蛋白质翻译过程。
基因转录问题可能包括基因突变、转录因子缺失、启动子区域的变异等。
2. 蛋白翻译问题蛋白翻译是将mRNA转化为蛋白质的过程。
如果翻译过程中出现错误，或者翻译过程被抑制，都会导致蛋白质不表达。
蛋白翻译问题可能包括启动子序列的变异、翻译起始子的缺失、翻译因子的不足等。
3. 蛋白修饰问题蛋白修饰是调控蛋白质功能和活性的重要过程。
如果蛋白修饰过程出现问题，也会导致蛋白质不表达。
常见的蛋白修饰问题包括磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰方式的缺失或错误。
蛋白不表达的影响蛋白质不表达可能会对生物体的正常功能产生重大影响。
1. 细胞功能受损蛋白质作为细胞内重要的功能分子，参与了细胞的各种生物学过程。
如果某些关键的蛋白质不表达，细胞的正常功能将受到严重的影响，可能导致细胞死亡、代谢紊乱等现象。
2. 器官和组织功能受损蛋白质的功能不仅限于细胞内部，还可以参与组织和器官的正常功能调控。
如果某些关键的蛋白质不表达，可能导致器官和组织的功能受损，进而影响整个生物体的生理活动。
3. 疾病的发生和发展蛋白质的不表达也可能与一些疾病的发生和发展密切相关。
例如，某些肿瘤细胞中特定的肿瘤抑制因子蛋白质不表达，导致异常的细胞增殖和分化，从而促进肿瘤的发展。
解决蛋白不表达的方法针对蛋白质不表达的问题，科学家们提出了一系列的解决方法。
1. 基因治疗基因治疗是利用基因传递手段将正常的基因传递给患者，从而恢复蛋白质的表达。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白不表达：常见原因及分析
根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图
3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤
其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-
端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr
这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
7、SD序列。
这个不陌生吧？考研时老师喜欢出名词解释，也难怪人家老是拿这个出题----SD序列和起始密码子序列（80%是AUG，也有GUG的）之间的距离，对蛋白表达的效率也有着非常重要的影响。
SD序列本身的组成对翻译效率也有影响。
有时为了减少包涵体的产生，还特别对SD序列进行修饰呢！
8、mRNA的二级结构。
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列。
如然，你最好进行同义密码子替换。
否则由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止的。
9、意外终止。
这种情况见于PCR扩增序列时，会和你开个不大不小的玩笑。
比如它会将序列中间TAC突变为TAA，让你的蛋白翻译刹车。
所以在进行表达之前，一定要进行测序，避免这种情况的发生。
10、转录终止子。
转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读”，没完没了地读下去。
这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。
如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。
如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。
11、mRNA的不稳定性。
靶基因的mRNA常聚集于细胞内。
但是大肠菌的mRNA及其不稳定。
如果在mRNA的5'-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。
尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA 在胞浆内无生命之虞。
12、检测方法的可行性。
有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。
这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。
说到对照，有很多层意思。
最基本的意思是，要设立空载体对照。
在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。
因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。
这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。
还比如说，某些蛋白具有异样性质，比如说流感病毒的HA，你拿表达的不同梯度稀释的蛋白做个
血凝。
如果发生血凝，并且呈现一定的梯度关系，那简直就是板上钉钉的事情了。
总结起来，套用一句很经典的电影台词：能表达出来的蛋白，其原因都是一致的；表达不出来的蛋白，各有各的原因。
我这个小帖子，就是给你一点启示：从哪里找原因。
希望能抛砖引玉，得到更多有价值的建议。