脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》610制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
五年制免疫实验课 小鼠脾脏单个核细胞分离-新
E花环分离法
（纯化T细胞）
T细胞表面的CD2分子－绵羊红细胞受体（E受体）
尼龙纤维分离法
B细胞和单核细 胞具有易粘附特性， 将淋巴细胞悬液加 到尼龙纤维上， 37℃作用1－2小时 后，洗脱的为非粘 附性T细胞。
PBMC
B细胞 单核细胞
尼龙纤维 毛柱
T细胞
流式细胞术
（Flow Cytometry，FCM）
一 、 T细 胞 增 殖 试 验
1. 形态学检查
T细胞增殖试验 原毒的行正理刺分常素激裂：）人后的T、转细能淋非化胞转巴率特体化为母异（外为细7性形0受体％胞有态特积左，丝学异较右以分示性大。此裂意抗、测原原图代定（物）谢T如质细旺P（胞盛HA的如、、功细且C能菌能on类进。A） 4P8H~A72刺小激时
NOTE：尽量少吸分层液；
6、每管加 PBS 到1ml，重悬细胞，3000转离心5分钟。
7、计数：吸弃上清，用100ml PBS重悬细胞，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
2.
3 H-TdR掺 入 法 T细胞增殖试验 原激胞养腺DD淋素NN活巴经进理液嘧AAβ后入细：中中啶的，胞-S淋加，液核原期进对巴入根体苷，料入刺细据闪3H细(被（细激T胞同烁标胞d摄胞物3位仪被RH记合入)周的素检-有，的T成期应细掺测d丝则DDR进答入胞。N分N掺3H行水A细A，裂入合-明有平胞T原掺法成d显丝。的RC入）原分掺增量o新n作料加裂入则A合为或脱，的，可成合P当同在氧推H细位的培成测胸A
医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FAC： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明
动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒使用说明规格：3×200mL/kit保存：动物脾脏单个核细胞分离液试剂盒对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
组成：各种动物脾脏单个核细胞分离液200mL全血及组织稀释液200mL细胞洗涤液200mL单个核细胞分离方法1.制备脾脏的单细胞悬液。
2.取一支适当的离心管，加入与脾脏单细胞悬液等量的分离液（分离液最少不得少于3mL，总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。
3.小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取单细胞悬液，然后小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。
）4.室温，500~900g，离心20~30min。
（根据脾脏单细胞悬液的量确定离心条件，单细胞悬液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件可以自行摸索，以达到最佳分离效果）。
5.离心后，此时离心管中由上至下细胞分四层。
第一层为稀释液层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层。
6.用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层至另一洁净的15mL离心管中，向离心管中加入10ml细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min。
7.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。
8.重复步骤79.弃上清，细胞重悬备用。
分层示意图脾脏单细胞悬液的制备方法脾脏研磨的方法：1.无菌条件下摘取脾脏，撕去脾脏被膜，用眼科剪将脾脏剪成小块。
2.将尼龙筛网或者是细胞过滤筛放置于平皿上，加入少量全血及组织稀释液（保证脾脏及获得的细胞处于液体环境中）。
3.将脾脏放置于筛网上，使用注射器活塞或者是无菌镊子来研磨脾脏（尽量控制研磨力度，保持筛网悬空，避免在皿底上直接研磨而造成大批细胞死亡）4.研磨完全后使用全血及组织稀释液冲洗筛网，收集细胞悬液，再经滤网过滤。
小鼠脾脏单个核细胞分离
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法
原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。
T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测
淋巴细胞转化试验
细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验
T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测
细胞生物学方法: CK细胞敏感株
密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092
在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
4 脾脏单个核细胞分离及流式细胞术染色(1)(1)
• 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 • 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS吹打混匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
补充知识
通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细 胞作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
计数完毕后请立即清洗细胞计数板！
思考题
1.实验过程中注意问题有哪些？
实验小鼠处死方法
• 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
实验四
小鼠脾脏单个核细胞分离及 流式细胞术染色
钱国军 邹本坤 2016-03-31
解剖图
小鼠脾脏位于上腹部左后侧， 体积较大，长条形，属于外 周免疫器官。外周血中淋巴 细胞可经再循环驻入脾脏等 外周免疫器官的特定区域， 所以富含各类免疫细胞。
实验原理
细胞计数
3mm
W1
W2
W3
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脾脏单个核细胞的制备
脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RPMI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白;
收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混
匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计
数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 10 / 300 µl 的浓度。
《流式细胞术检测小鼠
脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》
单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾
脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。
加入2 mL RPM I- 1640完
全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织
碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%
小牛血清的RPM I- 1640 培养液。
台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至
5×10 cells /L。
《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》
610
制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:
手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈
椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。
沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出
脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。
粗剪成小块, 用
注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加
人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。
收集滤过的细胞悬液, 加人0.83 % 的氯化铵到滤
过的细胞中, 静置5 min , 以除去血红细胞。
用RPM-ll640 培养液离心( 2500
r/min,10min) 洗涤细胞3 次, 以除去剩余的氯化铵将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培
养瓶中, 在37 ℃ 、5 % C O: 培养箱中静置培养2 h , 以除去贴壁细胞, 收集未贴壁的
细胞悬液即获得脾淋巴细胞。
计数接种培养。
台盼蓝染色计数, 活细胞数大于95 % 。
《从Ca2+通路研究紫草多糖促进小鼠淋巴细胞增殖的机制》
，
14日龄健康鸡，无菌取脾脏，Hanks'液洗3 次，卡介苗注射器芯研磨，200 目筛网
过滤，制成单细胞悬液，离心( 1000r/min) ，弃上清，Tris-NH4Cl 破解红细胞，冰水浴
放置10min，离心( 1000 r /min) ，弃上清，Hanks'液洗3 次。
加入无酚红1640 培养液重悬细胞，计数，调整细胞浓度为1 × 10 cell /mL。
于96 孔细胞培养板培养。
《马尾
藻多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖及氧化应激影响的实验观察》
6
1. 3 鼠脾淋巴细胞的制备小鼠脱颈处死, 于75% 酒精中浸泡5 min, 在超净工作台中无菌打开腹腔, 取出脾脏, 用含有高浓度青链霉素( 青霉素300 IU/ ml+ 链霉素
300μg/ ml) 的PBS液洗涤2-3 次, 剥去脾脏周围结缔组织。
将处理好的脾脏移入一无菌青霉素瓶中, 加入适量的RPMI1640 完全培养液( RPMI1640+ 10%胎牛血清+ 青霉素100 IU/ ml+ 链霉素100 μg /ml) , 眼科剪剪碎, 400 目网筛过滤, 收集滤液并叠加于等体积的小鼠淋巴细胞分离液上, 2000 rpm 离心15 min。
用无菌吸管取灰白层, 加入适量RPMI1640 完全培养液后, 1 000 rpm 离心5 min、去上清液, 用适量RPMI 1640 完全培养液重悬细胞, 取微量重悬细胞液, 加等体
6积0.4%台盼蓝染色液, 染色2 min, 计数活细胞后, 用RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为2 ×10 /ml( 细
胞活率95%以上) , 备用。
《苯对母鼠和子鼠脾淋巴细胞的增殖与凋亡影响》
2. 3. 2 脾淋巴细胞增殖功能检测。
处死小鼠后,各取脾脏8 个, 轻轻研磨成匀浆, 200 目筛网过滤, 制备脾细胞悬液, 离心, 1500 rm10m in, 弃上清, 加入适量红细胞裂解液( 1m l悬液中加3m l), 螺旋震荡3m in,
6PBS洗2次, 含10%胎牛血清的RPMI- 1640 培养液重悬, 调整细胞密度为2×10
/ml 加入96 孔U型培养板中,
每孔100μl。
分别加入ConA ( 10μg /m l) 100μl 使其终浓度为5μg /ml 每个标本3个复孔, 5% CO2培养箱中培养64h, 培养结束前4h加入MTT( 5mg /ml) 20μl 培养结束后离心1500 rm10m in, 小心吸去上清, 加入DMSO150μl 振荡10m in, 酶标仪
550nm 检测各孔吸光度(OD值)。
《复方阿胶浆对移植性肺癌小鼠脾、胸腺重量指数与脾淋巴细胞增殖影响》
1. 2. 2 淋巴细胞悬液制备分离小鼠的派氏结( Peyer S patches, PPs) , 肠系膜淋巴结( mesenteric lymph nodes, MLNs) , 脾脏( Spleen, SP) , 分别置于3 个盛有预冷PBS的无菌培养皿中, 用研磨棒加适度力度轻轻研磨, 于200 目筛网过滤, 收集细胞, 制备单细胞悬液, 以冷PBS 洗涤细胞两次( 1 200 r/ min, 5
7分钟) , 脾细胞以低渗法裂解红细胞, 细胞计数, 将细胞稀释到1×10cells/ ml。
《茯苓多糖对免疫抑制小
鼠粘膜淋巴组织及脾脏中CD3+ 和CD19+ 细胞变化的影响》
1.4.3 小鼠脾淋巴细胞增殖的测定小鼠颈椎脱臼处死，无菌取出脾脏，置盛有适量无菌Hank′s 液的小平皿中，用眼科剪轻轻将脾脏剪碎，经200 目筛网碾碎过滤，制成单细胞悬液，用Hank's 液洗3 次，每次离心10 min（1 000 r/min），去上清后加入预冷的0.83%Tris-NH4Cl 裂解红细胞1 min，再用1640 培养液洗涤2-3 次，然后将细胞悬浮于2 mL 完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数，调整细胞浓度为1.0×106 个/mL。
将细胞悬液分别加入96 孔培养板中，每孔100 μL，每组重复3 孔（见表2），各补加
完全培养基至200 μL。
置5%CO2培养箱37 ℃培养72 h，培养结束前4 h，弃去上清液，加入100 μL 不含胎牛血清的RPMI1640 培养液，同时加入MTT（5 mg/mL）10 μL/孔，
继续培养4 h。
培养结束后，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，吹打混匀，使结晶完全溶解。
然后用酶联免疫检测仪，以570 nm 波长检测、630 nm 波长参考，测定光密度值用
OD 表示。
1.5 数据分析采用SPSS13. 0 统计软件进行分析，结果以平均数。
《不同组分、不同纯度中药复方多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖影响》。