紫外分光光度法测蛋白酶酶活-2013
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。
2测定原理蛋白酶在一定得温度与pＨ条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（Ｆolｉn）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68０nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。
酶活单位得定义:每１mL粗酶液，在一定温度与pＨ值条件下,10min水解酪素产生１μｇ酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。
3仪器与设备3.1分析天平：精度为0、000１ｇ。
3.2紫外分光光度计.3.3恒温水浴锅:精度±０、2℃。
3.4ＰH计:精度为0、01PH单位.4试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。
4.1福林（Foliｎ）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42、4g/L）称取无水碳酸钠(Nａ2ＣＯ3）42、4g，用水溶解并定容至１000mｌ。
4.4三氯乙酸ｃ(ＣCl３COOH）=0、4ｍｏl/L称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至１000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c(NａOH）=０、5mol/L称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10００ml,摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及０、１ mol/L1 ｍol／L ＨCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至１000ｍL.0、1 mｏl/ＬHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1０00mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pＨ=７、5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Nａ２HPO4•12H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO４•1２H2O)0、５g，加水溶解并定容至１０00mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝３、0,适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸(8０％～90％）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
蛋白酶酶活测定方法
蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。
2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。
酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。
3.2紫外分光光度计。
3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。
3.4PH计：精度为0.01PH单位。
4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。
4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。
4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。
4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。
4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解蛋白酶活力测定的原理；2、掌握蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）：称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；② 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）；③ 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④ 5%三氯醋酸（TCA）溶液。
四、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1、A0、B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min（准确计时）后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法
葡萄糖 + ATP
己糖激酶 / Mg 2+
葡萄糖-6-磷酸 + ATP
葡萄糖－６－磷酸脱氢酶
葡萄糖-6-磷酸 + NADP
6-磷酸葡萄糖 + NADPH2
图 2：葡萄糖或 ATP 的间接酶检测 两种物质可以通过己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶催化的偶联反 应得以确定（偶联测试系统 [1]）。通过生成的 NADPH2 的量来计算 两种物质的量。
糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 解。葡萄糖通过分步反应转化为 2 分子的丙酮酸。1 分子的 葡萄糖生成 2 分子的 ATP 和 2 分子以 NADPH2 形式存在的 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 的降解产物是 H2O 和 CO2。
3C
迟”（Delay））加入己糖激酶开始的，总共检测时间为 6 分钟。
实验参数是根据初步实验使用 “单波长λ- 连续”（Singleλ-
continuous）（见上）设定的。以下公式分别用于计算酶活
性和底物浓度：
图 3：活性测定选项 A) 单波长λ- 连续 B) 简单动力学 C) 高级动力学 （Singleλ- continuous） （Simple kinteics） （Advanced kinetics）
Tris 缓冲液 pH 7.0 MgCl2 葡萄糖 NADP+ ATP 己糖激酶 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶
以上溶液均使用分子生物学用水进行制备，并在 Eppendorf IsoPack 冰盒中以 4 °C 保存。Tris 缓冲液在室温下保存。酶 在使用后立即放回冰箱。
紫外分光光度法对嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的测定方法研究
中木瓜蛋白酶的酶活力大小, 为判断嫩肉粉质量优劣提 供参考依 据。把嫩肉粉 溶于盐酸半 胱氨酸 溶液, 取该
混合液与酪蛋白溶液反应 10m in, 用紫外分光 光度法测 得反应 所生成 酪氨酸 的含量。该 方法具 有较好 的准确
性和重现性, 添加标准回收率为 96 8% ~ 105 8% ; 且步骤简明, 所需测试仪器简单。在该方法条件下, 每分
酶活力是酶性质的重要参数, 显示酶分解底 物能力的强弱。木瓜蛋白酶酶活力的测定, 采用 不同底物衍生的测定方法也不同, 所取得的数值 也不能进行直接比较。传统的作法, 木瓜蛋白酶 是用明胶或血红蛋白作底物来测定的。由于要求 底物具有较高的专一性和便于标准化, 新的测定 方法往往采用合成的 N - 苯甲酰 - L - 精氨酸乙酯 ( BA EE ) [ 3] 。但以 BAEE 为底物的测定 方法所涉 及到的仪器设备昂贵, 成本偏高 [ 4] 。本文采用以 酪蛋白为底物的紫外光谱法来测定嫩肉粉中木瓜 蛋白酶的活力, 该法所需测试仪器简单, 步骤简 明, 容易掌握; 并且该法也常被国内用来测定各 种酶的活力, 所得的数据便于比较。对嫩肉粉中 木瓜蛋白酶活力的测定, 可为嫩肉粉质量优劣提 供一项重要的参考指标。
入三氯乙酸溶液 5m L, 振摇, 置 ( 37 0 2) ! 水
浴中, 反应 10m in后, 准确加入 ( 37 0 2) ! 预
热的底物溶液 5 0mL, 振摇, 于 ( 37 0 2) ! 水
浴中放置 40m in, 用干燥滤纸过滤, 滤液在 2h内
采用分光光度法以水为空白, 在 275nm 的波长处
1 实验部分
1 1 仪器 恒温水浴锅; 751- GW 分光光度计。
1 2 试剂 酪蛋白溶液: 取酪蛋 白 0 6g, 加 0 05m o l/L
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2013/05/13
紫外分光光度法测蛋白酶酶活
1、原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。
2、试剂和溶液
三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。
2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。
2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
按GB601配制。
2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。
2.4 缓冲溶液
a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
2.5 10g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸
60 mL溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。
此溶液在冰箱内贮存或立即使用。
3 仪器和设备
3.1 恒温水浴40±0.2℃。
3.2 紫外分光光度计应符合GB 9721的规定。
4 分析步骤
4.1 求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。
4.2 测定
吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00 mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。
滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm 比色皿，测定其吸光度（A）。
a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；
b、按下列程序操作：
试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）
加酶液2.00 mL加酶液2.00 mL
40±0.2℃，2min 40±0.2℃，2min
加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）
40±0.2℃，10min（精确计时）40±0.2℃，10min（精确计时）
加酪素2.00mL(已预热)（摇匀）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）
继续加热10min，过滤或离心继续加热10min，过滤或离心
于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值
c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其它操作同 4.2。
标准曲线作同样处理。
5 计算
在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E
式中：X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL；
2——吸取酶液2.00mL；
1/10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的换算系数（中性、碱性蛋白酶系数为0.50；酸性蛋白酶系数为0.77）。
所得结果表示至整数。
6 结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3％。