紫外分光光度计测蛋白核酸及使用方法
紫外分光法测定蛋白质含量实验流程
紫外分光法测定蛋白质含量实验流程英文回答：Ultraviolet Spectrophotometry for Protein Quantification.Principle:Ultraviolet spectrophotometry is a widely used technique for protein quantification. It is based on the principle that proteins absorb ultraviolet (UV) light at a wavelength of 280 nm, primarily due to the presence of aromatic amino acids (tyrosine and tryptophan) in their structure. By measuring the absorbance of a proteinsolution at 280 nm, the concentration of the protein can be determined.Materials:UV-Vis spectrophotometer.Quartz cuvettes.Protein sample.UV-transparent buffer (e.g., phosphate-buffered saline)。
Procedure:1. Prepare the sample: Dilute the protein sample in the UV-transparent buffer to an appropriate concentration range (typically 0.1-1 mg/mL).2. Zero the spectrophotometer: Fill a quartz cuvette with the UV-transparent buffer and place it in the spectrophotometer. Set the wavelength to 280 nm and adjust the instrument to zero absorbance.3. Measure the absorbance of the sample: Replace the buffer cuvette with a cuvette containing the protein sample and measure the absorbance at 280 nm.4. Calculate the protein concentration: The protein concentration can be calculated using the Beer-Lambert Law:Concentration (mg/mL) = (Absorbance Dilution Factor) / (Extinction Coefficient)。
(完整版)紫外可见分光光度计--原理及使用
应用分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。
常用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
我们实验室主要是用来测物质的光度以求得物质的浓度或者酶活。
基本原理分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。
它是带状光谱，反映了分子中某些基团的信息，可以用标准光谱图再结合其它手段进行定性分析。
朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A= kcl式中比例常数k与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。
c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
组成各种型号的紫外－可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。
1.光源在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源。
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
2．单色器单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。
单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。
色散元件常用棱镜和光栅。
3.吸收池吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。
吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。
4、检测器检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。
现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。
5、信号显示系统常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。
操作步骤操作之前1.1开启电源进行初始化开启主机电源，分光光度计将按屏幕所显示的项目进行自检和初始化，如下图所示。
所有项目检测完毕，初始化结束，整个过程大约需要4min（若使用多池检测需5min）。
每个项目进行初始化操作时将被加亮显示，当初始化完成后，该项右边的星标也将加亮显示。
实验7紫外分光光度法测定核酸的含量(精)
四、试剂
1、5%~6%氨水 2、钼酸铵-高氯酸试剂（沉淀剂）。如配
制200mL可在193mL蒸馏水中加入 7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。
五、实验操作
1、用分析天平准确称取待测的核酸样品 500 mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入 少量的水稀释。然后用5%~6%氨水调至 pH7，定容到50mL。
实验7 紫外分光光度法测定核酸的含量
一、实验目的
1、了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理
和操作方法。
二、实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系 统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收 高峰在A260nm波长处。通常规定：在 260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液 其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA 溶液其光密度为0.024。
六、计算
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷 酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品 配制成一定浓度的溶液（20~50kg/mL） 在紫外分光光度计上直接测定。
五、实验操作
2、取2支离心管，向第一支管内加入2mL样品溶液和2mL 蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂， 以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置 30分钟后离心（3000r/min，10分钟）。从第一管和第二 管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。用光 程为1cm的石英比色杯，于260nm波长处测其光吸收值 （A1和A2）。
二、实验原理
故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波 长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。 此法操作简便。若样品内混杂有大量的核苷 酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定 误分析天平 3、容量瓶 5、吸管
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so---- 2co2+3so2+4h2o+nh3 ⑴2nh3+h2so4 --- （n h4）2so4 （2）（nh4）2so4+2nao- 2h2o+na2so4+2 nh3 ⑶反应（1）、（2）在凯氏瓶完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25 即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180°C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1•试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
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了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
紫外分光光度计使用方法
紫外分光光度计使用方法
紫外分光光度计是一种用于测量样品紫外吸收特性的仪器。
以下是使用紫外分光光度计的步骤：
1. 准备工作：将紫外分光光度计放置在平稳的台面上，确保仪器平衡。
检查光度计的光源和检测器是否处于正常工作状态。
2. 校准：使用标准溶液校准光度计。
选择适当的标准溶液，并按照仪器使用说明书中的步骤进行校准。
3. 准备样品：根据需要，将待测样品制备成溶液或固体。
确保样品处于透明状态，以便紫外光可以透过。
4. 装载样品：打开仪器的样品室，将样品放置在适当的位置上，并关闭样品室。
确保样品与光束的路径在同一直线上。
5. 设定参数：根据样品的特性和所需的测量范围，设置光度计的相关参数。
例如，选择适当的波长范围、光程长度和检测器灵敏度等。
6. 开始测量：启动光度计，开始测量。
仪器将通过发射紫外光并测量透射或吸收的光强，得到样品的光谱图或吸光度值。
7. 记录和分析数据：根据测量结果，记录并分析数据。
可以使用仪器自带的软件或其他外部软件进行数据处理和分析。
8. 清洁和保养：测量完成后，及时清洁样品室和其他附件。
定
期进行仪器的维护和保养，以确保其正常工作。
请注意，具体使用方法和步骤可能会因不同的紫外分光光度计型号而有所不同。
建议在使用前详细阅读仪器的操作手册，并按照其指示进行操作。
紫外-可见分光光度法在核酸分析中的应用
紫外-可见分光光度法在核酸分析中的应用摘要 综述紫外-可见分光光度法测定核酸总量的方法，总结紫外-可见分光光度法研究核酸与小分子之间的相互作用机理。
文中选用上海元析UV6100A 紫外可见分光光度计通过实验进行研究！关键词 核酸 紫外可见分光光度法 小分子1. 引言核酸是遗传信息的载体，在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。
它是以核苷酸为基本组成的生物信息大分子。
天然存在的核酸可以分为脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA) 两大类。
1953年watson 和crick [1]提出DNA 的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命遗传信息通过DNA 的半保留复制进行代代遗传的机理，从此生物学进入了分子生物学的新时代。
核酸在酶的催化作用下水解为核苷酸。
核苷酸完全水解可释放出等量的含氮碱基、戊糖和磷酸。
构成核苷酸的五种碱基分别为腺嘌呤(adenine, A ），鸟嘌呤(guanine, G ），胞嘧啶(cytosine, C ），胸腺嘧啶(thymine, T ）和尿嘧啶(uracil, U)。
其中，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶存在于DNA 和RNA 分子中，胸腺嘧啶仅存在于DNA 分子中，尿嘧啶仅存在于RNA 分子中。
DNA 存在于细胞核和线粒体内，携带遗传基因，决定着细胞和个体的遗传性；RNA 存在于细胞质、细胞核和线粒体中，参与遗传信息的复制和表达[2]。
因此，它在生命科学的研究中有着无与伦比的重要，其测定具有重要意义。
核酸是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础。
核酸在生物的生长、发育及繁殖等生命过程中起着十分重要的作用。
许多药物小分子能与核酸发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能[3]。
从生物学角度来看，DNA 的化学环境就是指DNA 周围存在的小分子化合物，研究这些小分子物质与DNA 的相互作用，对于认识小分子物质的活性及药物、污染物或毒物在生物体内的作用机理有着极其重要的意义。
紫外测定蛋白质的浓度吸收法
★★★★★实验6 紫外测定蛋白质的浓度吸收法一、目的1、了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。
2、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。
二、原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。
此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。
不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。
但可作为初步定量的依据。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、标准蛋白溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液。
2、待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg/mL的溶液。
（二）器具1、紫外分光光度计。
2、试管和试管架。
3、吸量管。
四、操作步骤（一）标准曲线法1、标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。
选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm 波长处分别测定各管溶液的A280值。
以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
12345678标准蛋白质溶液/ml00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0蒸馏水/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.00蛋白质浓度/（mg/mL）00.1250.2500.3750.5000.6250.750 1.00A 2802、样品测定取待测蛋白质溶液1mL ，加入蒸馏水3mL ，摇匀，按上述方法在280nm 波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
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实验记录及数据处理 测定未知浓度RNA溶液的浓度
紫外分光光度计使用方法
认识 紫外分光光度计
认识 紫外分光光度计
认识 紫外分光光度计
紫外分光光度计使用方法
开机自检，预热
紫外分光光度计使用方法
将对照及样品依次放入比色池中 选择“光度测量”模式
紫外分光光度计使用方法
输入测量所需的波长
3、仪器与试剂 紫外可见光分光光计。 未知蛋白质标准溶液，可用结晶牛血清蛋 白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定 蛋白质含量，根据其纯度配制成 1~2.5mg/mL 的溶液。 0.9%NaCl溶液。
4、实验步骤 在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶 液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为 对照，测得280nm和260nm两种波长的吸 光度（A280和A260）。将A280及A260波长处 测得的吸光度按下列公式计算蛋白质弄高 度 C=1.45A280-0.74A260 式中，C为蛋白质质量浓度（mg/ml）； 本法对微量蛋白质的测定既快又方便， 它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况 ，这时用其他方法测定往往较困难。
5、实验记录及数据处理 测定未知浓皿比较贵重，且易碎，使用 时要小心。 （2）测量吸光度时，比色皿要保持洁净， 切勿用手玷污其光面。
紫外分光光度计测定核酸含量
目的和要求 1、学习紫外吸收法测定核酸含量的原理。 2、掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量 的方法
紫外分光光度计使用方法
比色池推到对照组对准光源， 调100%透过 率
紫外分光光度计使用方法
比色池拉到样品组对准光源， 测试。测量 结果依次显示在屏幕上。记录数据。
紫外分光光度计使用方法
切换波长，同样程序再测量其他波长处样 品的光吸收值。。
实验器材 紫外分光光度计 实验材料及试剂 RNA或DNA样品
实验步骤 将样品配置成每毫升含5~50μ g的核酸溶液， 于紫外分光光度计上测定260nm处的吸光 度，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比 值： DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02 RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024
实验原理 DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大 吸收峰在260nm波长处。紫外吸收是嘌呤环 和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质， 所有嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外 线的性质。 用1cm光径的比色杯测定核酸的A260nm时， 1ug/ml的DNA溶液吸光度为0.020，同样 浓度的RNA吸光度为0.024.因此，可以用 下列公式计算样品的核酸含量 DNA浓度（ug/ml)=A 260/0.02 RNA浓度（ug/ml)=A 260/0.024
2、实验原理 蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香 族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收 峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度呈正比，故 可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含 量。由于核酸在280nm波长也有光吸收，对蛋 白质测量有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收 峰在260nm。如同时测定260nm的光吸收，通 过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如 溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及 260nm的吸光度，才能通过计算测定溶液中的 蛋白质浓度。