细胞免疫荧光技术ppt课件
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细胞免疫荧光技术
.
1
实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
.
2
实验原理
➢ 原位检测 ➢ 抗原抗体特异反应 ➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
.
3
实验用品
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
.
10
思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
.
11
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
PBS 洗涤
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃5-10min 荧光显微镜 观察
.
6
实验结果
三，观察
human HeLa cells
.
7
实验中应注意的问题
➢ 细胞不要铺的过密:60-70%
➢ 防止细胞污染 ➢ 固定时间不要太长,一般10-30min ➢ TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 ➢ 选择合适的封闭液 ➢ 二抗孵育后,一定要洗干净
➢ 组织固定不充分,自发裂解
➢ 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
.
16
四，染色不正确
可能的原因
➢ 固定方法对于抗原不合适 ➢ 抗原修复方法不合适 ➢ 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
➢ 尝试不同的固定剂或增加固定时间 ➢ 尝试改变抗原修复条件 ➢ 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
仪器：
荧光显微镜
.
4
实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
.
5
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
.
15
可能的原因
相应的措施
➢ 抗原修复方法过于剧烈
➢ 预实验摸索合适的修复条件
➢ 组织切片从玻片上脱落
➢ 增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
➢ 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 ➢ 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
➢ 组织形态难以分辨
➢ 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
必要时用恒Байду номын сангаас摇床摇洗
.
8
免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术
.
9
免疫细胞化学技术注意事项
➢ 选择合适的方法 ➢ 材料要留好 ➢ 选择抗体 ➢ 选择标记酶 ➢ 封闭液的选择 ➢ 设定对照实验
.
12
二，高背景
.
13
可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
.
14
三，细胞/组织的形态被破坏
有机(醇类)固定剂
.
17
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1
实验目的
➢ 掌握免疫荧光技术的基本原理 ➢ 熟悉细胞免疫荧光技术的方法 ➢ 了解在免疫细胞化学技术中如何
获得好的实验结果
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实验原理
➢ 原位检测 ➢ 抗原抗体特异反应 ➢ 间接法
抗体
抗原
激发光
显示荧光
荧光素标记 的抗抗体
Vinculin Hela细胞
间接荧光抗体染色法示意图
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实验用品
试剂：
固定液：4%PFA 细胞通透：0.2%TritonX 封闭试剂：10%正常山羊血清 一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体 二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgG DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚） PBS洗涤缓冲液：PH7.4
材料：
Hela细胞 细胞培养皿
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10
思考题
检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法， 用什么仪器观察？
A
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11
疑难解答
一，缺乏染色
可能的原因
➢ 无抗原 ➢ 抗体失效 ➢ 固定不充分 ➢ 过度固定 ➢ 抗原修复无效 ➢ 不兼容的二抗和一抗 ➢ 漏用试剂或未按正确的顺序
加入试剂
相应的措施
➢ 用原位杂交方法检测蛋白表达 ➢ 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 ➢ 增加固定时间或改用不同的固定剂 ➢ 减少固定时间;抗原修复 ➢ 增加修复时间或更换修复液 ➢ 使用可以与一抗结合的二抗 ➢ 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序
PBS 洗涤
PBS 洗涤
4℃过夜
37℃1-2小时 37℃5-10min 荧光显微镜 观察
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6
实验结果
三，观察
human HeLa cells
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实验中应注意的问题
➢ 细胞不要铺的过密:60-70%
➢ 防止细胞污染 ➢ 固定时间不要太长,一般10-30min ➢ TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 ➢ 选择合适的封闭液 ➢ 二抗孵育后,一定要洗干净
➢ 组织固定不充分,自发裂解
➢ 及时固定;增加固定时间; 提高固定剂/组织的比例;
将组织切得较小
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四，染色不正确
可能的原因
➢ 固定方法对于抗原不合适 ➢ 抗原修复方法不合适 ➢ 没有及时固定引起抗原的扩散
相应的措施
➢ 尝试不同的固定剂或增加固定时间 ➢ 尝试改变抗原修复条件 ➢ 立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换
仪器：
荧光显微镜
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实验步骤
一，细胞制备和细胞固定
将细胞铺在 24孔板中
将细胞培养 至所需密度
加入4%PFA 固定10min
染色 或保存
PBS洗涤
PBS洗涤
.
5
实验步骤
二，细胞免疫荧光ICC染色
加入一抗
加入二抗
加入DAPI复染
PBS 洗涤
0.2% TritonX 处理5min
封闭 室温30min
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15
可能的原因
相应的措施
➢ 抗原修复方法过于剧烈
➢ 预实验摸索合适的修复条件
➢ 组织切片从玻片上脱落
➢ 增加固定时间;烤片;
使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片
➢ 组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡 ➢ 使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域
➢ 组织形态难以分辨
➢ 切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水
必要时用恒Байду номын сангаас摇床摇洗
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免疫细胞化学技术
标记物
使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
1. 免疫荧光技术 2. 免疫酶技术 3. 免疫亲和技术 4. 胶体金技术
.
9
免疫细胞化学技术注意事项
➢ 选择合适的方法 ➢ 材料要留好 ➢ 选择抗体 ➢ 选择标记酶 ➢ 封闭液的选择 ➢ 设定对照实验
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12
二，高背景
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13
可能的原因
➢ 一抗或二抗的浓度过高 ➢ 一抗和/或二抗与组织的
非特异性结合 ➢ 组织过于干燥 ➢ 试剂粘附在旧的
或未制备好的玻片上
相应的措施
➢预实验摸索最佳浓度 ➢一抗孵育前封闭
(最好是二抗来源的血清) ➢在染色过程中避免组织干燥 ➢用新鲜制备或购买的玻片进行实验
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14
三，细胞/组织的形态被破坏
有机(醇类)固定剂
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