6叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量测定 浙江大学植物生理学实验课件
生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》实验报告
生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》实验报告实验目的：1. 学习叶绿体中色素的提取和分离的方法；2. 观察叶绿体中不同色素的吸收光谱。
实验原理：叶绿体是植物细胞中的特殊细胞器，其中含有多种色素，包括叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝卜素等。
这些色素能够吸收不同波长的光线，并转化为化学能以参与光合作用。
本实验利用溶剂提取和色谱柱分离的方法，将叶绿体中的色素提取出来，并通过紫外-可见光分光光度计测定不同色素的吸收光谱。
实验步骤：1. 取一片鲜叶（最好选择深绿色的叶片）切碎，加入适量的乙醇或醋酸乙酯中浸泡，使叶绿体释放出色素。
注意保持容器密封以避免光照。
2. 将浸泡片刻半小时，使叶绿体彻底释放色素。
3. 将叶绿体悬液过滤，收集含有色素的过滤液。
4. 取一支色谱柱，填充色谱吸附剂（如硅胶），再用无色溶剂（如正己烷）预洗一次。
5. 将收集到的含色素液体加入色谱柱中，用无色溶剂洗脱，收集不同色素的洗脱液。
6. 用紫外-可见光分光光度计测定不同色素的吸收光谱。
实验结果：根据实验数据得到不同色素的吸收光谱曲线，可观察到叶绿素 a 在400-500 nm波长范围内有最大吸收峰，叶绿素 b 在450-550 nm波长范围内有最大吸收峰，类胡萝卜素在500-600 nm波长范围内有最大吸收峰。
根据吸收光谱的不同，可以推测各色素在光合作用中的吸收波长和参与的反应。
实验结论：通过该实验，我们成功地提取和分离了叶绿体中的色素，并观察到不同色素的吸收光谱。
这些实验结果可以帮助我们深入了解植物光合作用的机制，以及不同色素在光合作用中的作用。
同时，该实验也展示了提取和分离生物样品中化学物质的基本实验技巧和原理。
叶绿体色素的提取分离与理化性质实验报告
叶绿体色素的提取分离与理化性质
二、实验原理：
叶绿体中主要成分为叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素，这些色素不溶于水而易溶于有机溶剂，所以用乙醇做提取剂。
提取液用薄层层析法加以分离。
由于硅胶对不同色素的吸附性不同，在展开剂带动各种色素向上移的过程中，有的速度慢有的速度快，从而彼此分开成单独的色带。
叶绿素可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变为激发态，变回基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素容易受强光破坏，而类胡萝卜素较稳定。
叶绿素中的镁可被氢离子取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。
三、实验仪器和材料：
1.菠菜叶
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钾—甲醇溶液。
3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸，刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管。
四、实验步骤：。
生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》
生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》随着社会一步步向前发展，我们都不可避免地要接触到报告，写报告的时候要注意内容的完整。
那么，报告到底怎么写才合适呢？以下是小编整理的生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》，欢迎大家分享。
生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》1一、实验目的1. 学会提取和分离叶绿体中色素的方法。
2. 比较、观察叶绿体中四种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系二、实验原理光合色素主要存在于高等植物叶绿体的基粒片层上，而叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中。
故要提取色素，要破坏细胞结构，破坏叶绿体膜，使基粒片层结构直接与有机溶剂接触，使色素溶解在有机溶剂中。
叶绿体中的色素有四种，不同色素在层析液(脂溶性强的有机溶剂)中的`溶解度不同，因而随层析液的扩散速度也不同。
三、材料用具取新鲜的绿色叶片、定性滤纸、烧杯、研钵、漏斗、纱布、剪刀、小试管、培养皿、毛细吸管、量筒、有机溶剂、层析液(20份石油醚、2份丙酮、1份苯混合)、二氧化硅、碳酸钙。
四、实验过程（见书Ｐ54）1.提取色素：2.制备滤纸条：3.色素分离，纸层析法。
（不要让滤液细线触及层析液）4.观察：层析后，取出滤纸，在通风处吹干。
观察滤纸条上出现色素带的数目、颜色、位置和宽窄。
结果是：4条色素带从上而下依次是：胡萝卜素(橙黄色)、叶黄素(黄色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶绿素b(黄绿色)。
五、讨论1.滤纸条上的滤液细线为什么不能接触到层析液？2．提取和分离叶绿体中色素的关键是什么？生物实验报告《叶绿体中色素的提取和分离》2一、实验目的1、学会提取和分离叶绿体中色素的方法。
2、比较、观察叶绿体中四种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系二、实验原理光合色素主要存在于高等植物叶绿体的基粒片层上，而叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中。
故要提取色素，要破坏细胞结构，破坏叶绿体膜，使基粒片层结构直接与有机溶剂接触，使色素溶解在有机溶剂中。
叶绿体色素的提取分离理化质和定量测定
六、实验结果观察及计算
（1）实验结果观察描述
（2）计算组织中叶绿体色素含量
（用mg/g鲜重或干重表示）
公式
叶绿素的浓度（C） 提取液体积 稀释倍数
叶绿体色素含量=
样品鲜重（或干重）
七、思考题
（1）叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？ 为什么？
叶绿素中镁可被H+取代而形成褐色去镁叶绿素。 去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。 皂化反应： 叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿 醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水--分开叶绿素 与类胡萝卜素。
2. 定量测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分 光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用 公式计算出提取液中各色素的含量。
四、 实验步骤
1. 提取叶绿素
研磨法 材料剪碎 加入有机溶剂
研磨、匀浆 过滤 提取液
研磨法提取光合色素
荧光现象
（2）纸层析分离现象观察
去镁叶绿素
（3）叶绿素荧光现象观察
（4）H+和Cu2+对叶绿素 中Mg2+的取代作用
（5）皂化反应现象观察
铜代叶绿素 绿黄色素分层现象
五、定量测定
（1）定量用叶绿素提取液制备 （2）分光光度计测定 （3）实验数据及其处理
（2）用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水 丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体 色素往往效果不佳，原因何在？
（3）研磨提取叶绿素时加入CaCO3. 石英砂 各有什么作用？
Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） Cb=22.88D645 - 4.67D663 （2） 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（3） 或：
《叶绿体色素的提取和分离》 实验报告
《叶绿体色素的提取和分离》实验报告实验目的1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。
2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。
3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。
实验原理叶绿体色素包括绿色的叶绿素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色的类胡萝卜素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，它们均以色素蛋白复合体形式存在于类囊体膜上。
两类色素均不溶于水而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
由于提取液中不同色素在固定相和流动相中的分配系数不同，所以可借助分配层析方法将其分离。
实验仪器与药品1. 绿色植物如菠菜等的叶片。
2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。
3. 95％乙醇、石英砂、碳酸钙、展层剂。
展层剂按石油醚：丙酮：苯10:2:1的比例配制（V／V）。
实验步骤1. 叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其它新鲜植物叶片4～5片（4g左右），将其洗净、擦干并去掉中脉，剪碎后置入研钵中。
（2）研钵中加入95％乙醇2～3 ml及少许石英砂、碳酸钙研磨至匀浆，再加95％乙醇5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。
2. 叶绿体色素的分离（1）取圆形定性滤纸一张（直径应小于康维皿直径）于其中心扎一圆形小孔（直径约3mm），另取长方形滤纸条一张（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿滤纸条的长度方向涂抹，注意涂抹色素扩散宽度应限制在0.5cm以内，风干后再重复操作数次。
然后沿长度方向将滤纸条卷成纸捻，使涂抹过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。
（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。
（3）在康维皿中央小室中加入适量的展层剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿中央小室上，使纸捻下端浸入展层剂中，迅速盖好培养皿。
展层剂将借助毛细管作用顺纸捻扩散至圆形滤纸上，使叶绿体色素在固定相（滤纸中吸附有水分的纤维素）和流动相（展层剂）间反复分配，从而使不同色素得到分离，分离结果为滤纸上可见到各种色素的同心圆环。
叶绿体色素的提取理化性质与含量测定
2.4 叶绿素含量的计算
1）叶绿素a、b分别在665nm和649nm波长处（95%乙醇提取）有最大的 吸收峰，同时在该波长处叶绿素a，b的比吸收系数K为已知，我们即可以 根据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：
Ca=13.95A665 – 6.88 A649 Cb=24.96 A649 – 7.32 A665 CT =Ca + Cb= 18.08 A649 + 6.63A665
浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速 分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。
叶绿素的理化性质
1）吸收光谱 红光区：640~660 nm；篮紫光区：430~450 nm 。 2）荧光现象 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。 3）皂化反应 叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶
3ml提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）603℃mi水n 浴 冷却 + 3ml苯（摇匀） + 3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀） 静置，观察分层现象。
下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）； 上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 对照：另取3ml 叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和2ml 蒸馏水观察与皂化 的叶绿素有何不同？ （结果与分析3）
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×稀释倍数×提取液体积] /样品鲜重
比较两种方法所得的实验结果。 （结果与分析5）
5. 结果与分析
详见实验步骤（结果与分析1-6）
6. 注意事项
1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行， 研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。
2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。 3）分光光度计的正确使用。
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定1 实验目的（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；（2）验证叶绿体素的理化性质。
2 实验原理2.1 叶绿素的提取叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。
2.2 叶绿素的分离薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
2.3 叶绿素理化性质测定叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。
2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
叶绿体色素的提取实验报告
叶绿体色素的提取实验报告叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定生命科学学院09生科基朱文杰实验目的：掌握提取和分离叶绿体色素的方法；掌握测定叶绿体色素含量的方法；熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。
实验原理：叶绿体色素是吸收光能的重要物质，包括叶绿素和类胡萝卜。
利用不同色素的极性不同可以用色谱分离法将其分离。
不同的色素对光的吸收范围不同，因此我们也可以测量不同色素在不同波长光下的吸光值，即可用公式计算出其中各色素的含量。
光对叶绿体色素有破坏作用，将叶绿体色素暴露于强光下，可以发现叶绿素被破坏，溶液颜色变化。
叶绿体色素分子吸收光后变为激发态，如能量不被光合作用利用，激发态变回到基态，放出波长较长的红光。
叶绿素分子中卟啉环上的Mg处于不稳定的状态，可被H、Cu、Zn离子取代。
叶绿素不溶于水，能溶于有机溶剂，且各色素的脂溶性不同，故可利用乙醇或丙酮提取，用不同的有机溶剂萃取或用色谱法进行分离。
实验步骤：分别选取2g左右新鲜菠菜和0.2g左右玉米幼株的叶片剪碎放入研钵中。
在研钵中加入5ml丙酮以及少量的石英砂和氯化钙，充分研磨至无纤维装组织。
过滤并转移动至量筒中，再用3ml丙酮冲洗研钵，最后加入丙酮定容至10ml 作为备用提取液。
实验一：吸光值测定：取0.1 ml色素提取液，用80％丙酮稀释到3 ml ，测定663、645 nm 处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。
Chla（μg /ml）=12.7 OD663－2.69OD645，Chlb （μg /ml）=22.9 OD645－4.68 OD663。
实验二：光破坏：取少量色素提取液并稀释3到5倍，分为2份，一份至于暗处，一份正对观察透射光，反身观察反射光，最后放在培养箱中的强光下放置2H。
实验三：铜带反应：取少量色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色。
然后加醋酸铜晶体少许，慢慢用水浴加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆
•
过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射
光 光。
皂化反应(3ml)
加KOH数片剧烈 摇均，加石油醚
5ml和H2O 1ml 分层后观察
上层呈 ，吸收 。 下层呈 为 光。
色，为 光
色。 。吸收
取代反应（1）
加醋酸约2ml，变 褐（ 叶绿素） 取1/2加醋酸铜粉 加热变 色， 为 叶绿素。
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析： • 鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，各取0.2ml
加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清 液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和 Chl总量的值。
• 五、实验数据记录和处理
• 实验6 叶绿体色素的提取、分离、 理化性质和叶绿素含量的测定
• 一、实验目的和要求：掌握植物中叶绿体 色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理 和方法。
• 二、实验内容和原理：以青菜为材料，提 取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定 和叶绿素含量分析。原理如下：
1、叶绿素和类胡 萝卜素均不溶于
水而溶于有机溶
剂，常用95%的 乙醇或80%的丙 酮提取。
2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，
形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中
的类胡萝卜素分开。
C32H30ON4Mg
COOCH3
COOC20H39 COO—
+ 2KOH
C32H30ON4Mg
+ 2KOH +CH3OH +C20H39OH COO—
• Ca(mg/L)=12.7OD663-2.69 OD645
• Cb (mg/L) =22.9OD645-4.68 OD663
• CT (mg/L) = Ca+ Cb 或OD6521000/34.5
• Chla含量(mg/g.FW)= （Ca(mg/L)/1000）
•
2/ 0.1 5/ 0.2
• Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）
Relative absorbtance
180
160
140 a
b
120
100
80
60
40
20
0
400
500
600
700
Waverlength(nm)
• 三、主要仪器设备： • 1、天平（万分之一）、可扫描分光光度
计（）、离心机
• 2、研具、各种容（量）器、洒精灯等 • 四、操作方法与实验步骤：
• 1．定性分析：
•
2/ 0.1 5/ 0.2
• Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）
•
2/ 0.1 5/ 0.2
• 六、实验结果与分析
• 1、吸收光谱图谱分析
• 2、定量分析
• 7、讨论、心得 • 1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光？ • 2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定
叶绿素的吸收光谱？
H3C—
C
C CC
NC
C CC
NC
H3C
CH2 CH
CC C
R1—C C
N
C CC NC
CH3
HC
Cu
CH
—CH3
H3C—
C
褐色
绿色
• 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射 光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色
反射光下呈红色
5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光 区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶 绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
？ ？
• 3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉
环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶
绿素和绿色的铜代叶绿素。
• H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ 。
C CC CN
C CC CN
CH2
H3C
CH
CC C
R1—C C
N
C CC NC
CH3
HC
HH
CH
—CH3
取代反应（2）： 鲜叶2-3cm2，加AcAcCu 20ml加热。观 察： min变为 色的 叶绿素， min后，变为 色 的 叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层 黄色石油醚溶液
反复用石油醚粹取,直到无类胡 萝卜素,离心得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1） （稀释663nm OD 0.5-1）