细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验，你做对了吗？
细胞克隆形成实验，你做对了吗？“克隆”顾名思义，即体细胞无性繁殖，1个细胞分裂成2个细胞，进行种群繁殖并扩大的过程，通过克隆形成率可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状，是体外测定细胞增殖能力的一种常用技术。
这项实验虽然操作简单，却有很多同学在最终拍照时很难拿到好看的图片，不得不一次又一次重复实验，今天我们就看看如何规范的做克隆形成实验。
克隆形成的目的1. 评价不同杀伤因素（药物、基因等）对肿瘤细胞增殖能力或群体依赖性的敏感性；2. 评价细胞在体内成瘤性，癌细胞不一定都可以在体内成瘤，但若体外克隆能力越强，即表明体内成瘤性越强，算是一种模拟体内成瘤的体外实验。
克隆形成实验步骤a.接种：取对数期生长的细胞以500-1000个/孔的密度接种于6孔板（接种时注意梯度稀释细胞悬液，观察细胞密度，以免因计数不准确导致实验结果偏差），每个实验组设3个复孔，培养基为含30%FBS的完全培养基；b.于细胞培养箱中培养7-14天左右，每隔3天进行换液并观察细胞状态，显微镜下观察克隆大小（3复孔之间克隆大小应相似），待单个克隆生长到大小不超过图片视野时可以进行拍照（如下图左）c.固定染色：移除培养基，PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛固定细胞20 min；移除多聚甲醛，用0.2%结晶紫染色5min；用水洗涤细胞，晾干，扫描拍照；（如下图右）d.计数注意！注意！注意！高能预警细胞密度为多少合适？细胞接种密度与最终实验结果密切相关，若细胞太多，形成克隆数目太多，很难拍到单独的克隆团。
而细胞太少，可能无法形成克隆，从而影响对该细胞增殖能力的判断。
一般来说，正常增殖速度为1:5-1:10传代，3天长满细胞，可以接种500个细胞，其余增殖缓慢细胞，可以接种800-1000。
细胞接种后培养的时间，如何确定？通常情况下，单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆，时间约为一周；但具体时间因细胞增殖能力而已异，因此应密切关注细胞生长情况，隔天在显微镜下观察克隆情况，若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。
细胞克隆形成实验
细胞xx形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软xx集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板xx形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
细胞克隆实验过程及原理
细胞克隆实验过程及原理细胞克隆实验，听起来是不是有点高大上的样子？别担心，今天我就给大家扒一扒这个看似复杂的实验到底是个什么玩意儿！细胞克隆实验其实就是在实验室里把细胞像复制粘贴一样，生生造出一大堆一模一样的细胞。
说到这儿，你可能会问，为什么要这么做呢？哎，细胞克隆可不是为了让我们在朋友圈里发“我有一模一样的姐妹”那种图啊，而是为了科学研究、医疗应用和一些生物技术的开发。
现在，咱们就一步一步地来看这个过程和原理。
1. 实验准备1.1 材料准备在做细胞克隆实验之前，得准备好一堆材料。
首先，咱们需要细胞源。
可能是小鼠的细胞，也可能是人类的细胞，当然，如果你能找到外星细胞，那也是可以的，哈哈！然后呢，还得准备培养基，简单来说就是细胞的“饭”。
没有好吃的，细胞可不乐意生长啊。
再来就是培养器皿，比如培养皿、试管啥的。
这些都是细胞的“家”，细胞在里头就像人在家里待着一样，舒服得很。
还有一些必要的工具，比如移液管、显微镜，这些就像是科学家的“武器”，帮助我们观察和操作。
1.2 实验环境别忘了实验环境也很重要哦！细胞对环境要求可高了，温度、湿度、pH值都得调得刚刚好，简直比我对房间的温度要求还要严格。
实验室要保持无菌，这就像是在大厨做菜时要保持厨房的干净，细胞才不会被细菌“袭击”。
2. 克隆过程2.1 细胞分离接下来，咱们就进入核心环节——细胞分离。
首先，用一些酶把细胞从组织里分离出来，想象一下就像是把苹果从果皮里挖出来。
分离好的细胞会被放到培养基里，像是在自家的小厨房里吃饭。
经过一段时间，它们就开始在这片“美食”中慢慢繁殖。
2.2 细胞传代等细胞长得差不多了，我们就得进行传代了。
这个过程简单来说就是把一部分细胞移到新的培养皿里，就像是把一些小草莓移植到新的土壤里继续生长。
这样一来，细胞就能在新的地方继续繁殖，越来越多。
随着时间的推移，细胞会不断分裂、复制，最终形成一个细胞克隆群体。
3. 观察与分析3.1 显微镜观察当克隆细胞繁殖到一定数量时，我们就可以用显微镜来观察这些细胞。
原代细胞克隆形成实验原理
原代细胞克隆形成实验原理一、引言原代细胞克隆是指通过将原代细胞分离并培养，使其形成与原代细胞相同的克隆细胞群体。
这种技术被广泛应用于生物医学研究、生物工程和农业领域，对于细胞的功能研究、药物筛选和基因改造具有重要意义。
本文将介绍原代细胞克隆形成实验的原理和步骤。
二、原代细胞克隆形成实验原理原代细胞克隆形成实验主要基于细胞的增殖特性和分化能力。
细胞增殖是细胞生命周期中的一个重要过程，通过细胞分裂可以产生两个或更多的细胞。
分化是指细胞在特定条件下转变为特定类型的细胞。
在细胞克隆实验中，我们利用细胞的增殖特性和分化能力，将原代细胞分离并培养，使其形成克隆细胞群体。
三、原代细胞分离原代细胞分离是实现细胞克隆的第一步。
通常，我们从动物或植物组织中取得原代细胞，例如从小鼠胚胎中获取胚胎成纤维细胞。
然后，利用消化酶或机械方法将组织分解成单个细胞。
分离后的细胞可通过显微镜观察验证。
四、原代细胞培养原代细胞分离后，需要将其培养在适当的培养基中，提供细胞所需的养分和环境条件。
培养基的选择对于细胞的生长和分化至关重要。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640和MEM等。
此外，培养基中还需要添加血清和抗生素等物质，以促进细胞的增殖和防止细菌污染。
五、细胞增殖和分化原代细胞在培养基中经历细胞增殖和分化的过程。
细胞增殖是指细胞通过分裂产生新的细胞，从而形成细胞群体。
细胞分化是指细胞根据特定的信号和环境条件转变为特定类型的细胞，具有特定的功能和形态。
在培养过程中，细胞会不断增殖和分化，形成克隆细胞群体。
六、细胞筛选和传代在细胞克隆形成实验中，为了获取具有相同遗传特性的细胞群体，需要对细胞进行筛选。
常见的筛选方法包括荧光染色和细胞表面标记等。
筛选后的细胞可以进行传代，即将细胞分离并继续培养。
传代可以使细胞持续增殖和分化，保持克隆细胞的稳定性和纯度。
七、应用领域和前景原代细胞克隆形成实验在生物医学研究、生物工程和农业领域有着广泛的应用。
(完整版)细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
细胞克隆形成实验
精心整理细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力正常?(a)??(b)?1、10%210mL373、2次。
加4%10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：?(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
?(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
?(3)按3mL温箱中备用。
?(4)按0.2mL 置入37(5)不超过将1.21.4ml10000个/ml加1ml CO2的1.接种时细胞密度适度，不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
克隆形成实验原理及步骤
克隆形成实验原理及步骤嘿，咱今儿就来讲讲克隆形成实验的那些事儿！你知道吗，这克隆形成实验就像是一场细胞的奇妙冒险之旅。
先来说说原理哈。
这就好比是让细胞们去参加一场“克隆大赛”，看谁能繁衍出最多的“子孙后代”。
细胞们在合适的环境里，就会开始分裂、增殖，形成一个个小小的克隆群体。
这就像是星星之火，可以燎原一样，一个小小的细胞也能发展成一大片呢！那具体步骤是咋样的呢？首先得准备好细胞啦，就像给运动员们准备好比赛场地一样。
把细胞小心翼翼地种在培养皿里，给它们提供舒适的“家”。
然后呢，就是耐心等待啦，看着它们一点点地生长、分裂。
这过程可不简单哦，就像看着小树苗慢慢长大，得时刻关注着，可不能出啥岔子。
接着，经过一段时间后，就可以看到培养皿里出现了一个个的小克隆啦！哇，那感觉就像是看到自己精心培育的花朵终于绽放了一样惊喜。
这时候，就得给这些小克隆们“拍照留念”啦，用合适的方法把它们标记出来，记录下它们的样子和数量。
你说这是不是很神奇？就这么一个小小的实验，能让我们看到细胞的强大生命力和繁殖能力。
这就像是打开了一扇通往微观世界的大门，让我们对生命的奥秘有了更深的了解。
想想看，如果没有这样的实验，我们怎么能知道细胞是怎么工作的呢？怎么能找到治疗疾病的新方法呢？所以说啊，这克隆形成实验可真是太重要啦！在做这个实验的时候，可得细心再细心哦，就像照顾小宝宝一样，不能有一点马虎。
每一个步骤都得做到位，不然可就得不到准确的结果啦。
这就好比搭积木，一块没放好，可能整个城堡就垮啦！总之呢，克隆形成实验是生物学研究中非常重要的一部分。
它让我们能更好地了解细胞的特性和行为，为医学、生物学等领域的发展做出贡献。
所以啊，大家可得好好了解了解它，说不定哪天你也能亲自去尝试一下呢！你难道不想去探索一下这个神奇的细胞世界吗？。
细胞克隆形成实验
1．2．3克隆形成分析(1)药物处理T25培养瓶中细胞以基础培养基洗1遍，并在基础培养基中饥饿2d'时，然后换回条件培养基，以恩度(200ng／m1)、顺铂(8pM)以及两药联合使用，标准条件下孵育细胞6d,时。
其中，涉及到恩度处理时，在饥饿后半程即以相应浓度的恩度预处理细胞1小时。
实验设对照(contr01)。
(2)细胞接种吸弃培养基，胰酶工作液分别收集细胞，以条件培养基洗2遍后，将细胞悬浮于条件培养基中，计数3次，取均值，调整细胞悬液浓度至1 x103／ml。
6孔培养板中加入2．6ml条件培养／孔，在C02培养箱中平衡后，每孔加入0．4ml细胞悬液(400个细胞)，终体积为3ml。
接种时十字方向摇晃培养板，振动培养板边，使细胞尽量均匀分布。
其中，涉及到恩度处理过的细胞，在接种过程中使用含有200ng／ml,恩,度的条件培养基。
(3)细胞培养细胞在标准条件下培养2～3周，每3天更换条件培养基，观察克隆形成情况。
其中，以恩度干预的细胞，换液时使用含有该浓度恩度的条件培养基。
(4)克隆染色当细胞形成肉眼可见的克隆(每个克隆细胞数在50'--'150个左右)时终止培养。
弃去培养基，用DPBS(O．01moUL，pH 7．4)小心浸洗细胞2次后，加入甲醇lml／孔，固定15min后，弃去固定液，以流水缓慢冲洗干净，每孔加入lml的姬姆萨使用液染色30min，以流水缓慢洗去染色液，通风橱中干燥。
(5)克隆计数将培养板放置在凝胶成像系统，使用可见光条件，以随机所带软件计数克隆数目，扫描并保存图像。
克隆形成率(％)=克隆数目／接种细胞数x100％。
调整后的克隆形成率(％)=克隆形成率(％)／对照组克隆形成率(％)。
每种药物处理的细胞样本接种3个复孔，独立重复3次实验。
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细胞克隆形成实验
当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：
一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：
平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验
(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞
(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：
1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2〜3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用
PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10〜30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100%
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：
（1）取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DME培养液调整细胞密度至1X106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
（2）用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40C中不会凝固。
⑶按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2X DME培养基（含有2＞抗生素和20%勺小牛血清）混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中（10cm平皿加7〜10mL）,冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
⑷按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2X DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL 的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。
待上层琼脂凝固后，置入37 T 5%CO2温箱中培养10〜14天。
（5）把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。
计算形成率。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40C。
接种细胞的密度每平方厘米不超过35 个, 一般6cm的平皿接种1000个细胞。
正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
软琼脂集落形成率实验（软琼脂克隆）
将1.2 %低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.6 %的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml，将0.6 %低熔点琼脂糖与2X田胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well），混匀，室温凝固。
置于37T，5% CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。
注意事项
1. 接种时细胞密度适度，不可过高。
2. 软琼脂与细胞混合时温度不能超过40C，否则将会烫伤/死细胞；
3. 琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
因此高压灭菌后应进行分装；
4. 细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响；
5. 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/ 株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。
因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞
米松等促克隆形成物质。
6. 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
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