细胞克隆形成率实验
大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定
大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定陈婉;甘春兰;赵文青;吴煜;蔡捷【摘要】目的:分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定.方法:采用酶消化法分离获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法纯化细胞,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,抗波形丝蛋白及角蛋白、抗STRO-1免疫化学染色.体外分化诱导实验检测细胞的多向分化能力.结果:分离纯化获得的大鼠牙髓干细胞在体外具有一定的克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1均有表达.诱导条件下部分牙髓干细胞具有多向分化的潜力,符合干细胞特征.结论:成功从大鼠牙髓中获取牙髓干细胞.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2014(031)006【总页数】5页(P901-905)【关键词】大鼠牙髓干细胞;细胞克隆;免疫化学;诱导分化【作者】陈婉;甘春兰;赵文青;吴煜;蔡捷【作者单位】广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学附属口腔医院南宁530021;广西医科大学医学科学实验中心【正文语种】中文【中图分类】R-33目前研究已证明，许多组织器官的更新都是通过干细胞来维持的，当牙齿受到酸蚀、龋坏或机械损伤时，成牙本质细胞受到破坏, 牙髓组织可以形成修复性牙本质以保护受损牙齿，说明牙髓组织中可能含有牙髓干细胞。
2000 年Gronthos 等[1，2]首次提出牙髓干细胞的概念，并证明其具有生成牙髓牙本质样复合物的能力，可分化为功能性的成牙本质细胞，形成牙本质。
Miura 等[3]于 2003 年首次在脱落的人类乳牙中也发现了多潜能干细胞，为牙髓干细胞的研究开辟了一个新的领域。
本实验以大鼠牙牙髓为研究对象，采用酶消化分离法并加入有限稀释法，获得纯化的大鼠牙髓干细胞，并对其生物学特性及多向分化能力进行研究，为今后的牙髓干细胞相关研究奠定基础。
1 材料和方法1.1 实验动物：选取健康2个月龄Wistar大鼠，均为雄性，体重为(250±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混 合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝 固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消 化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调 整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞 悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿 接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细 胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用 此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬 液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形 成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞 生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱 ，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状 态。
THANKS
Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。
平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。
细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
软琼脂集落形成实验
1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
应用极限稀释细胞克隆形成实验方法检测血清活力
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细胞克隆形成实验注意事项
细胞克隆形成实验注意事项细胞克隆是一种重要的实验技术，可以用来研究细胞生物学、疾病发生机理、药物筛选等方面。
然而，进行细胞克隆实验时需要注意一些细节，以确保实验的准确性和可重复性。
以下是一些细胞克隆形成实验的注意事项。
一、实验前的准备工作1.准备培养基和培养皿选择适合细胞生长的培养基，并在实验前将其预热至37°C。
同时，清洁和消毒培养皿，避免细菌和真菌的污染。
2.校准培养条件保持培养室和实验室的温度、湿度和CO2浓度在适宜值，可以通过温度计、湿度计和CO2计进行监测和校准。
3.准备细胞悬液将需要克隆的细胞悬液均匀搅拌，确保细胞的均一性和活力。
4.准备实验仪器和试剂根据实验需要准备好显微镜、离心机、培养箱、培养皿等仪器，以及细胞传代所需的酶解液、胰酶等试剂。
二、细胞传代前的操作1.检查细胞形态在进行细胞传代前，用显微镜观察细胞的形态和数量，确认细胞悬液的质量和纯度，避免由于细胞的老化或污染导致实验结果的不准确。
2.离心分离细胞将细胞悬液离心分离，去除培养基和杂质，以保证下一代细胞的生长环境和纯度。
3.酶解细胞使用合适的酶解液和酶，对细胞进行酶解，以分离细胞并保持其活力。
4.计数细胞用血细胞计数板或细胞计数仪对酶解后的细胞悬液进行计数，确保每一次传代的细胞数量精确。
5.调整细胞密度根据实验需要，调整细胞的密度，使之适合于进行克隆实验。
三、细胞克隆实验中的注意事项1.选择合适的细胞密度在进行细胞克隆实验时，要保证每个克隆在培养皿中有足够的空间，避免细胞之间的相互影响和竞争。
2.设计合理的对照组在进行细胞克隆实验时，要设计好对照组，以便比较实验组和对照组之间的差异。
3.查看细胞生长状态在进行细胞克隆实验过程中，经常观察和记录细胞的生长状态，包括形态、数量和分化情况等，及时发现并解决问题。
4.避免细菌和真菌污染在进行细胞克隆实验时，要保持实验环境的清洁和消毒，避免细菌和真菌的污染，影响实验结果的准确性。
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不克不及有细胞团，接种密度不克不及过大。
软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
接种细胞的密度每平方厘米不超出35个，正常细胞在悬浮状态下不克不及增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解 1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中坚持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不克不及发生气泡）。
对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。
7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中坚持。
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▪ 按一定细胞数量（照射0、0.5、1Gy组接 种300个/皿，照射2Gy接种600个/皿，照 射4Gy组接种2×103个/皿，照射8Gy组接 种1×104）接种于60 mm培养皿，每个剂 量组3个皿
▪ 照射不同剂量的60Co γ射线
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细胞克隆形成率实验
黄波
南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心
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目的
▪ 1.了解辐射对细胞增殖的影响 ▪ 2.掌握细胞培养的基本技术 ▪ 3.掌握辐照细胞的方法，细胞克隆技术
博学之，审问之，慎▪ 1.取对数生长期的细胞，用PBS洗干净后 胰酶消化，离心。