软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混 合，加入到6孔板中，每孔1.5mL,室温等其凝 固。
➢ 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消 化终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调 整细胞浓度为5X104/mL,每孔加入100uL的细胞 悬液。
三、注意事项
➢ 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
➢ 试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。
➢ 接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，一般6cm的平皿 接种1000个细胞。
➢ 软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细 胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用 此种方法。
软琼脂克隆形成实验
➢ 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2X培养基1:1混合，加入100uL的细胞悬 液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。
➢ 放入37℃，CO2培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形 成率。
软琼脂克隆形成实验
➢ 软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞和转化细胞的增殖能力。
➢ 克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞 生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大正常细胞克隆形成率弱 ，肿瘤细胞强。
软琼脂克隆形成实验
二、实验方法
➢ 配制1.2%和0.7%的琼脂糖，高压灭菌后置于 55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状 态。
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Hale Waihona Puke 软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Assay）
软琼脂克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。
当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。
平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。
单克隆抗体技术：克隆化(有限稀释法、软琼脂克隆化、显微镜操作
单克隆抗体技术：克隆化(有限稀释法、软琼脂克隆化、显微镜操作经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。
克隆的时间一般说来越早越好。
因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。
但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。
克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。
克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。
一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。
克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
有限稀释法1．材料（1）微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。
（2）HT培养基2．操作方法（1）取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。
并取样进行台盼兰染色，计数。
（2）用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
（3）用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
（4）5％CO2饱和湿度，37℃培养。
（5）每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
（6）克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。
（7）抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。
软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。
3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。
克隆全过程
1.目的基因~~~~~~产物纯化回收将带有目的条带的琼脂糖凝胶，在紫外灯下用已灭菌的刀片,延条带边际仔细切割条带(切割胶块时动作要快，在紫外灯下暴露的DNA易降解，在切胶时尽量一个一个的切，每切一次，关闭紫外灯)。
然后将其放入商品纯化柱内，进行片段纯化。
（具体方法步骤按照AXYGEN纯化试剂盒说明操作）(1)计算凝胶重量，以该重量作为一个凝胶体积，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全融化。
(2)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。
(3)吸取上述步骤中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min.弃滤液。
(4)将制备管置回2ml离心管，加500ulBuffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。
(5)将制备管置回2ml离心管，加700ulBuffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。
(6)重复（5）。
(7)将制备管置回2ml离心管，12000×g离心1min。
（空离）(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加25~30ulEluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。
(9) 跑胶观察是否有纯化结果。
(10) 纯化产物放-20℃保存，备用。
2.扩增片段的克隆纯化的片段连接到克隆载体pMD19-T vector，转化导入宿主菌大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选，获得含所需要的目的片段的质粒。
2.1 扩增片段3’端加“A”尾（此步骤一般不用）反应体系：10×Buffer 1μlMgCl2 (25mM) 1μldATP (10mM) 1μl纯化的PCR产物5μlTaq酶(5U/μL) 1μlddH2O 补齐10μl混匀，瞬间离心，收集到管底。
70℃保温30min，取2μl进行连接反应。
肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验
Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。
(完整版)细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿.试验胜利的关键是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过年夜.软琼脂培养法经常使用检测肿瘤细胞和转化细胞系.接种细胞的密度每平方厘米不超越35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验.1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫.2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃.提前融化血清和双抗.3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中坚持.4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔.5、铺下胶：按1:1比例使 1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能发生气泡）.对一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）.6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰卵白酶消化并轻轻奏乐，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成份的稀释水平.每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104.7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中坚持.再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml.待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周.8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥.9、计数克隆：把平皿放置在颠倒显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中年夜于50个克隆数(﹥)和所有克隆数，克隆形成率=年夜于50个克隆数\所有克隆数×100%.每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照.10、数据处置：每个视野的面积是1mm22,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数×960，如果要比力﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就获得总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比力.。
克隆形成琼脂平板.doc
学海无涯
克隆形成-琼脂平板
1、(细胞被干预（药物处理，转染，电转，感染）24小时后，作活细胞计数（台盼蓝染色），用完全培养基调整细胞密度至1×105 /ml（活细胞）；
2、(用超纯水分别配制1%的标准琼脂糖和0.7%的低溶点琼脂糖，高压灭菌后4℃保存，使用时，微波炉加热溶解，然后放在40℃水浴中至少平衡30min；
3、按1:1比例把1%的标准琼脂糖和完全培养基混合后，取1.5mL混合液加入35mm平皿中，冷却凝固作为底层琼脂；
4、把0.75 ml 0.7%的低溶点琼脂糖和0.75 ml完全培养基混合后，再向管中加入5,10,15,20,25或30μl细胞悬液，充分混匀，加入铺有底层琼脂的35mm平皿中，待上层琼脂凝固后，加入0.5-1ml完全培养基，置入37℃，5%CO2温箱中培养7-14天，每隔3-4天更换培养液；
5、待细胞克隆长至合适大小（100-200uM）取出，结晶紫染色，然后把盖子拿掉，用照相机拍照，注意拍6孔板的全貌, 手工计数克隆的数量，对数据进行统计分析；
6、实验周期比较长，一定要注意无菌操作，可以在培养液中加抗生素防止污染；注意事项：
1. 每孔接种细胞的数量，上面设计了6个细胞梯度，已经充分考虑了各种细胞的大小与生长速度；
3. 注意无菌操作，整个检测窗口为期7-14天，期间污染风险一定要控制；
4. 细胞接种至6孔板是否继续进行细胞干预？决定于处理因素起作用的时间；。
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注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。
接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST
REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。
2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。
提前融化血清和双抗。
3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后
放入42℃水浴锅中保持。
4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3
个复孔。
5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每
孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。
对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。
6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，
作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。
每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。
7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需
先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。
再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。
待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。
8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。
9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数
视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。
每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克
隆数=平均克隆数×960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。