免疫组化—ABC试剂盒法
免疫组化技术(原理分类步骤及主要试剂设备准备
免疫组化技术原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫1酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
小鼠组织切片免疫组化实验步骤
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
详细实验方法•小鼠组织切片免疫组化实验步骤实验材料•小鼠试剂、试剂盒•二甲苯•无水乙醇•95%乙醇•EDTA抗原修复工作液•TBS•DAB显色液仪器、耗材•石蜡•烘箱•电炉材料二甲苯酒精（100％，95％）EDTA抗原修复工作液（pH8.0，稀释50倍使用）0.5M Tris-NaCl (TBS) pH7.4（稀释10倍使用）DAB显色液（临用前配制：试剂盒A、B、C各50ul，于1ml水中混匀）。
方法1. 石蜡切片置60℃烘箱中烘烤过夜2. 二甲苯中脱蜡，梯度酒精入水(无水乙醇，95％酒精)，浸泡于蒸馏水中待用3. 抗原修复取500mlEDTA抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上加热，至似沸微沸（为了防止脱片）。
将组织切片缓慢放入烧杯。
继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。
将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。
4. 每张切片加一滴或50ul 3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
TBS冲洗3次，每次3min。
5. 除去TBS液，加一滴或50ul 一抗（灭活PLB免疫小鼠所得到的多抗，1:3000稀释），阴性对照采用普通血清，室温下孵育2小时，或4℃过夜。
6. TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ul poly mer enhancer（试剂A），室温下孵育20min，TBS冲洗3次，每次3min。
7. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 过氧化物酶标记的抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。
免疫组化知识普及、二抗免疫组化试剂盒
R i s MultiVision n Polymer s 10min e
R i s LV Blue n 10min
s e
卖点：
• 针对兔、鼠来源一抗 • 微聚合物二抗混合液，明显降低显色背景n 10min
s
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R i s Counterstain n (Optional) s e
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R i s Rabbit antin mouse enhancer s 10min e
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i s Anti-rabbit n Polymer s 10min
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i s DAB n Quanto/Plus s 5min
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R i s Counterstain n s e
卖点：
•用于人标本检测，增强鼠来源一抗的显色强度 •用于啮齿类标本的检测，对兔来源一抗有效
免疫组化知识普及、二抗免疫组 化试剂盒
优宁维缪娓
直接法
• 直接法是将酶（如HRP）标记在特异性一抗上，然后用酶 标记抗体直接与相应抗原特异性结合，形成抗原-抗体HRP复合物，最后用酶底物显色。
• 优点：简单、步骤少、省时、特异性高。 • 缺点：敏感性差
间接法
• 我这边的讲的间接法就是酶标记在二抗上， 再与一抗反应，然后进行显色反应。
试剂盒里包含 •Mayer's Modified Hematoxylin •Bluing Reagent •Mounting Medium
MultiVision Detection Kit
货号 HRP Systems TL-012-MHRA
TL-012-HARH
品名
试剂盒包含
体积
MV Polymer Mouse Red Rabbit Blue
免疫组化试剂
免疫组化免疫组化是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。
免疫组化试剂盒：Vector Laboratories公司VECTASTAIN@ ABC免疫组化试剂盒：Vector公司于1977年率先开发出了生物素-亲和素系统，该产品系列是检测方法上的重要革命。
其后，公司发展出ABC技术（Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术），并建立了著名的VECTASTAIN®ABC系统，目前，该系统被视为最灵敏、最可靠与最有效的染色系统，并被广泛应用于免疫组织化学、免疫电镜、原位杂交与凝集素化学中。
ABC技术利用生物素和卵白素具有极高亲和性的生物学特征，将卵白素和生物素化辣根酶按照一定的比例混合，形成ABC复合物。
该法亦被称作三步法，第一步为biotin化二抗和一抗结合，第二步为avidin（亲和素，A液）和二抗上的biotin结合，第三步为HRP偶联的biotin（B液）和avidin结合，而HRP再催化底物显色完成染色。
试剂盒组份：2ml试剂A（Avidin DH溶液）2ml试剂B（生物素化的酶）1ml生物素化的二抗（1.5mg anti-IgG/0.5mg anti-IgM抗体/2.1mg通用抗体）3ml阻断血清其中standard试剂盒只含有试剂A和试剂BVECTASTAIN®ABC系列产品VECTASTAIN®ABC-HRP Kits（辣根过氧化物酶）最通用的系统，使用范围广VECTASTAIN®ABC-AP Kits（碱性磷酸酶）灵敏度较高，染色密度较低，适于形态学染色非常重要的组织VECTASTAIN®ABC-GO Kits（葡萄糖氧化酶）灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或AP 含量比较高的组织，常与HRP或AP系统配合进行双染。
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组化—ABC试剂盒法
免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程一、工作液准备1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子；2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子；3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。
此处反应需要30min。
1滴大概50uL4、试剂（自备）二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀二、步骤1.脱蜡和水化脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
8.PBS洗3次每次2min。
9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。
10.PBS洗3次每次2min。
11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。
12.PBS洗3次每次2min。
13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
免疫组化需要注意事项
免疫组化需注意的问题一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
为达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。
如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。
四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。
新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。
然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。
免疫组化判读方法
免疫组化判读方法
免疫组化结果的判读方法如下：
1. 必须设阳性对照和阴性对照。
阳性对照是已知的阳性标本，用于验证试剂和技术方法的可靠性；阴性对照是已知不含待测抗原的标本，用于确定本底情况。
如果阳性对照阴性，表明检测操作方法可能有误，需要重新检测。
2. 抗原表达必须在特定部位。
有些免疫组化的定位在细胞膜，有些在细胞质，有些在细胞核，所以在特定部位阳性表明是真正阳性；如果在非特定部位阳性，或者整个切片阴性，都会判定免疫组化是阴性，或者是假阳性。
此外，根据使用的染色方法不同，判读方法也有所不同。
例如ABC法（卵
白素-生物素-过氧化物酶复合物法）和SP法（抗生物素蛋白链酶素-过氧化物酶复合物法）。
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免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程
一、工作液准备
1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子；
2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子；
3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。
此处反应需要30min。
1滴大概50uL
4、试剂（自备）
二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4
DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀
二、步骤
1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；
2）无水乙醇中浸泡5min；
3）95%乙醇中浸泡5min；
4）70%乙醇中浸泡5min；
2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
8.PBS洗3次每次2min。
9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。
10.PBS洗3次每次2min。
11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。
12.PBS洗3次每次2min。
13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14.蒸馏水洗，苏木素复染45s。
15.脱水：把切片放入50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，每次2min。
16.透明：将切片放入100%二甲苯10min透明。
17.中性树脂50ul封片，室温保存。
备注：
1、VECTOR试剂盒只提供封闭血清、生物素二抗、ABC复合物。
一抗、过氧化氢、DAB 需自备。
2、步骤9、11的敷育时间可在37度下缩短。
3、配置工作液时尽量用新鲜的缓冲液，以防细菌污染影响染色结果。
4、配置ABC复合物用的A液和B液应该是同一试剂盒的。