多重荧光免疫组化染色试剂盒
HER2检测试剂盒(免疫组化法)说明书-Agilent
DAB 显色液。 5% 3, 3’-二氨联苯胺四盐酸显色剂溶液。
3×500mL
2×5
抗原修复液（包含清洗剂）（10×）。 0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，1% 吐温-20，pH 5.7。
质控切片
P04605CN_01_SK00121-2CN/2017.02 2/26
P04605CN_01
10 × 试剂瓶
外。该试剂盒所提供的材料足够用于最多 10 次免疫组化染色。
数量
说明
1×22 mL
过氧化物酶阻断剂。 3%的过氧化氢，含有15 mmol/L的叠氮钠（NaN3）。
1×12 mL
1×22 mL
兔抗人HER2多克隆抗体。 即用型亲和分离的抗体,保存在0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 1%BSA, 酒 石黄(Tartrazin), 专利蓝V(Patentblue V), 15 mmol/L NaN3, pH 7.2溶液中。 免疫原：合成的HER2蛋白的C-末端（细胞质部分）片段部分，并偶联至血蓝蛋 白上。
2×22 mL
阴性质控试剂。
与HER2抗体等价蛋白浓度下的正常兔血清免疫球蛋白成分，保存在0.05 mol/L Tris/HCl, 0.1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3, pH 7.2，并含有1%BSA稳定剂的溶液 内。
1×1mL
DAB底物缓冲液。 50 mM咪唑, 1mM N, N'-乙基双 (2-[2-羟基苯基]甘氨酸) (EDHPA), 0.1%乙基苯基 聚乙二醇（Nonidet P-40）, 0.02% 过氧化氢, 0.01% 氯化苯二甲烃铵, pH 7.5。
【检测原理】
HercepTest™检测试剂盒包含对常规处理的、石蜡包埋的样本进行两步法免疫组化染色 所需要的全部试剂。兔抗人 HER2 蛋白一抗孵育后，该试剂盒采用基于葡聚糖技术的即用型 显色试剂。该试剂包含羊抗兔二抗和偶联至葡聚糖多聚体骨架上的辣根过氧化酶分子。因此， 不需要再依次使用连接抗体，人免疫球蛋白显色试剂和胎牛血清之间的交叉反应也因为使用 固相吸附材料而消除。依次填加的色素原的酶转换，也使得显色反应发生于抗原所在部位。 标本需要复染和封片。反应结果在光学显微镜下观察。质控玻片包含 3 个福尔马林固定、石 蜡包埋的人类乳腺癌细胞系，染色强度分别在 0、1+、以及 3+，提供用于对染色结果进行 评估。这些细胞的染色强度与其所表达的受体密度一致。
多色免疫荧光染色试剂盒使用说明
多色免疫荧光染色试剂盒使用说明多色免疫荧光染色试剂盒使用说明酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采纳HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。
之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来其次轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
TSA具体原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与四周的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增加。
简洁来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。
荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟接近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。
再换个一抗来其次轮孵育，周而复始。
等到全部抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最终去检测结果。
由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担忧抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大削减了试验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。
也就是说，假如用TSA技术，同一张片子上全部的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。
搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行试验，而且信号放大的倍数大大增加。
茹创生物开发的试剂盒详细酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。
免疫组化—ABC试剂盒法
免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程一、工作液准备1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子；2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子；3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。
此处反应需要30min。
1滴大概50uL4、试剂（自备）二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀二、步骤1.脱蜡和水化脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。
6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
8.PBS洗3次每次2min。
9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。
10.PBS洗3次每次2min。
11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。
12.PBS洗3次每次2min。
13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
科普讲堂细胞染色的快、准、狠
引言概述：细胞染色是生物学和医学领域中一项重要的实验技术，通过使用染色剂将细胞内特定的结构或分子染色，从而能够更清晰地观察和研究细胞的结构和功能。
本文将继续探讨细胞染色技术的快速、准确、高效的方法。
正文内容：1.快速染色方法：1.1原位染色技术：原位染色技术利用特定的染色剂直接将目标分子染色，如荧光原位杂交（FISH），可以在短时间内获得高分辨率的染色结果。
1.2快速染色试剂盒：市场上现有的快速染色试剂盒，如液基细胞学染色试剂盒，能够在几分钟内完成染色过程，并且结果准确可靠。
2.准确染色方法：2.1免疫组化染色技术：免疫组化染色技术通过利用特异性抗体和酶联反应，能够准确地染色目标蛋白质、细胞器或细胞表面分子，广泛应用于病理学和细胞生物学研究。
2.2激光共聚焦显微镜：激光共聚焦显微镜结合荧光标记技术，能够以亚细胞级别的分辨率观察和研究细胞结构，提供准确的染色结果。
3.高效染色方法：3.1多参数流式细胞仪：多参数流式细胞仪结合多重荧光染色技术，能够同时检测多个目标分子的表达和功能状态，提高染色效率和准确性。
3.2增强染色灵敏性的方法：如放大革片染色法、醛固定染色法等，通过改进染色条件和处理方法，增强染色反应的灵敏性，提高染色效率。
4.详细阐述小点：4.1影响细胞染色效果的因素：样本处理、染色剂的选择和浓度、染色时间和温度等因素对细胞染色效果有重要影响。
4.2不同细胞类型的染色方法差异：由于细胞类型的差异，不同染色方法对不同细胞类型的适应性也有所不同，需要根据具体情况选择合适的染色方法。
4.3细胞硬化剂的应用：细胞硬化剂能够改变细胞的形态和结构，有助于染色剂的渗透和固定，提高染色效果。
4.4图像处理和分析软件的应用：图像处理和分析软件能够对染色结果进行定量分析和三维重构，提高研究的准确性和效率。
4.5细胞染色的应用领域：细胞染色技术广泛应用于病理学、生物医学研究、药物筛选、遗传学等领域，对疾病的诊断和治疗提供重要依据。
多重荧光免疫组化技术的主要流程
多重荧光免疫组化技术的主要流程一、样品处理在进行多重荧光免疫组化实验前，首先需要处理样品。
对于细胞样品，可以通过离心、洗涤等步骤准备细胞悬液。
对于组织样品，需要进行固定、脱水、包埋等处理，以保持组织结构的完整性。
二、抗原解表抗原解表是多重荧光免疫组化实验的关键步骤之一。
通过将样品暴露在适当的条件下，如高温、酶解等，可以使细胞或组织中的抗原裸露出来，为后续的抗体结合提供条件。
三、抗体染色在多重荧光免疫组化实验中，需要使用多个抗体来检测不同的分子。
这些抗体通常是与特定荧光染料偶联的，以便在显微镜下观察到荧光信号。
在进行抗体染色前，需要对抗体进行充分的验证和优化，以确保其特异性和敏感性。
四、荧光显微镜观察在完成抗体染色后，需要使用荧光显微镜观察样品。
荧光显微镜可以通过激发荧光染料发出的荧光信号来获得高分辨率的图像。
通过调整显微镜的参数，如放大倍数、曝光时间等，可以获得清晰的荧光图像。
五、图像处理与分析在获得荧光图像后，需要进行图像处理和分析。
常见的图像处理软件可以用于调整图像的亮度、对比度、色彩平衡等，以提高图像的质量。
同时，可以使用图像分析软件对荧光信号进行定量分析，如计算荧光强度、定位分子的相对位置等。
六、结果解读根据实验结果进行结果解读。
多重荧光免疫组化技术可以同时检测多个分子的表达和定位情况，因此可以提供更全面的信息。
通过对荧光信号的定量分析和图像的解读，可以得出对样品中不同分子的表达和相互作用的结论。
在进行多重荧光免疫组化实验时，还需要注意以下几点：1.选择适当的抗体和荧光染料，确保其特异性和互补性；2.控制实验条件的一致性，如温度、时间等，以保证实验的可重复性；3.合理设计实验对照组，如阳性对照、阴性对照等，以验证实验结果的准确性；4.注意光线的干扰，避免荧光信号的混杂和干扰；5.合理选择荧光显微镜参数，以获取清晰的图像。
多重荧光免疫组化技术是一种强大的工具，可以同时检测多个分子的表达和定位情况。
多重标记免疫组化小知识
常规的多重标记免疫组化，其原理、荧光素配伍及流程优化如下：
基本原理：
多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。
采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重免疫组化染色技术。
荧光素配伍：
FITC（异硫氰酸荧光素）——翠绿色，常与呈红色的罗丹明或TRITC（异硫氰酸四甲基罗丹明）配伍。
流程优化：
•抗体稀释，染色前先摸索单通道下每个单抗的量佳浓度范围。
•抗体与荧光素匹配，平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度。
•染色顺序优化，保证多次加热切片不会影响后面靶点表位的完整性。
•构建光谱库
爱必信多重荧光免疫组化染色试剂盒，采用TSA技术，基于酪酰胺的信号放大技术能够检测用传统方法无法检出的低丰度靶标，且无需担心抗体交叉反应，以及一抗。
免疫组化经验总结第一部分步骤及常见问题
免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。
肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。
2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。
⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。
切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。
（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。
如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。
再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。
但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。
第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。
6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。
滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。
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多重荧光免疫组化染色试剂盒
肿瘤微环境系列
【背景介绍】
免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫治疗的崛起，越来越多肿瘤微环境中的标志物被发现与疾病治疗、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求。
爱必信公司多色试剂盒是利用酪氨信号放大技术（TSA）把抗体和荧光染料进行优化组合，开发了一系列可以同时标记检测多种生物标记物的荧光免疫组化试剂盒。
【产品简介】
肿瘤微环境是由肿瘤细胞、与癌症相关的成纤维细胞和免疫细胞、以及上述细胞的分泌产物（如细胞因子和趋化因子）和细胞外基质中的非细胞成分构成。
肿瘤微环境系列染色试剂盒可以标记角蛋白（pan-CK）、T细胞、髓系来源的免疫细胞、免疫检验点蛋白，每个试剂盒可任选其中3 个marker。
【用途】
主要用于肿瘤微环境系列TILs的免疫荧光染色。
【技术原理】
酪氨信号放大技术（TSA）采用HRP 标记的二抗，HRP 催化加入体系的荧光素底物，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，试样品上稳定地共价结合荧光素。
之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
图1 酪氨信号放大技术原理
【实验流程图】
图2 多重荧光免疫组化染色流程图
【产品优势】
高科研价值：分人、鼠两个系列，方便在小鼠肿瘤模型和人样品上进行平行实验，进行转化医学研究；
高兼容性：选用荧光染料标记适用于所有配备了紫外、FITC、CY3、CY5 等波段的荧光显微镜、共聚焦显微镜和荧光切片扫描设备；
稳定性：加样过程无需避光操作，样品染色完4度保存半年，-20℃保存一年荧光信号依然满足拍照需求；
方便性：所有抗体都经过筛选，特异性好，染色浓度均经过优化，减少研究者自己摸条件的过程。