人工诱发单倍体及其应用

（四）花药培养与花粉培养的异同点
– 培养目的相同，均获得小孢子植株。
– 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞 培养。 – 花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。
二、 花药培养技术
（一）研究历史： 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是 印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花 药培养成功。
• ③花粉粒的鉴定；
• ④气孔密度测定。
一、单倍体植株的鉴定
2. 直接鉴定：染色体数目的检测，也是最准 确的倍性鉴定方法。
• ①根尖的鉴定； • ②幼穗或花蕾的鉴定；
二、单倍体植株的二倍化
秋水仙素Байду номын сангаас
1. 浓度的选择 2. 处理时间的选择 3. 助渗剂使用
花粉植株的倍性及染色体加倍
1. 对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性：
养—植株再生
花药的剥取：
避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组
织的发育，形成二倍体的愈伤组织。
花药预处理
• 大量试验结果表明，花药培养前给予一 定的低温处理是十分必要的。
花药培养常用的基本培养基： N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物 的花药培养 B5、MS、White、Nitch 等。 C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。
单核花粉粒（单核靠边期）
精细胞
有丝分裂
双核早期
精细胞 (3-细胞花粉粒）
N
选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉 是否处于适宜的发育期。
最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物 的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法， 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
（二）花药培养的基本程序是：
外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培
二、 植物单倍体在植物遗传育种中的应用
应用： 1. 利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育种速度 ； 2. 排除显隐性基因的干扰，提高育种的选择效率； 3. 遗传分析； 4. 物种进化研究。
第二节 花药培养
一、 概述
概念
花药培养和花粉培养是获 是植物单倍体的有效方法之一
• 花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在
供体植株 花粉培养 小孢子（N） 雄核发育
花粉植株 （N）
自然加倍 人工加倍
纯合植株 （2N）
一年内获得纯系
（2）提高了目标基因型的选择效率 例：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中 选择基因为AAbb的纯合单株
常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能 将AAbb与Aabb、aAbb区分开。
（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体
（2）A-G途径
由生殖细胞重复分裂形成单倍体
（3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细 胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合， 形成多倍体植株
（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径
2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分 裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这 两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核 融合形成多倍体植株。
2. 预处理：如低温冷藏 3. 材料灭菌 4. 花粉植株诱导
花药和花粉培养中的白花苗
白化苗的控制
花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接 种时花粉发育时期的延迟而提高。
培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分 化出更多的白化苗 培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也 随之增加。
AB AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB aB AaBB aaBB AabB aabB Ab AABb aABb AAbb aAbb ab AaBb aaBb Aabb aabb
（2）提高了目标基因型的选择效率 例：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中 选择基因为AAbb的纯合单株
花粉培养技术
• 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进 行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子
花粉培养技术
• 4、花粉的培养
• 平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 • 液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震 荡，以利通气。 • 双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活 花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体 培养基培养。 • 看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活 性物质促进花粉小孢子发育。 • 微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微 室进行花粉培养。
花粉植株的形态发生方式
1 、胚状体发育途径： 小孢子经历胚发生的各 个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。
烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株
花粉植株的形态发生方式
2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次 形成愈伤，再分化形成花粉植株。此
途径产生的植株会出现变异且倍性复
杂。
水 稻 花 药 培 养 的 愈 伤 化 发 生 途 径
二、 植物单倍体在植物遗传育种中的应用
单倍体的优点： 1. 单倍体的每个染色体组都是单的，加倍后，由不育 变可育，快速纯合； 2. 单倍体每一种基因都只有一个，在单倍体内，每个 基因都能发挥自己对性状发育的作用，不再区分基 因的显隐性，是研究基因性质及作用的优良材料； 3. 异源多倍体的各个染色体组之间并不是绝对异源的 ，一些染色体组间的染色体可能存在部分同源的关 系，对研究物种起源和进化有帮助。
激素：相对较低的激素水平 蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利 培养条件－温度和光照： 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度 2％ 3％ 4％ 6％ 10％ 13％ 17％ 诱导频率 5％ 10％ 12％ 18％ 25％ 45％ 8％
第三节 花药培养注意的问题
1. 材料选择（基因型；生理状态；光照；花 药发育时期）
花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作 物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。
（二）花药培养的基本程序是：
外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培
养—植株再生
外植体的选择：
供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花
粉的发育时期等。
四分体
4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） （两者仅以质膜相隔） 生殖细胞（小） （2-细胞花粉粒）
第四节 花粉培养
•花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒, 使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱 分化,进而发育成完整植株的过程.
花粉培养技术
• 1、取材时期：四分体时期到单核早期。
花粉培养技术
• 2、花粉的分离：
1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接 种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落 后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的 花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤 出后收集培养。
一、 植物单倍体与人工诱发单倍体的应用
人工诱发单倍体（artificial induced haploid）——单倍 体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植 物体。 人工诱发单倍体的方法： 1. 组织和细胞离体培养 2. 远缘杂交 3. 体细胞染色体消失 4. 异质体 5. 孪生苗 6. 半配合和辐射等
4. 单倍体植株的鉴定
1）形态学鉴定
2）染色体分析
5. 单倍体植株的二倍化
①小苗浸泡法
②生长锥处理
③培养基加倍
①体细胞干扰 ②生殖细胞的自发加倍
花粉植株的倍性及染色体加倍
2. 花粉植株的倍性：
单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体 3. 影响非整倍体植株出现的频率的因素：
• ①植株的种类
• ②接种花粉的发育时期
• ③培养基中激素的浓度和种类
• ④花粉植株发生的方式 • ⑤愈伤组织继代培养时间长短
花粉植株的倍性及染色体加倍
人工培养基上,使其发育和分化成为植株的
过程.
单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点： 体细胞染色体数减半；
生长发育弱，体形小、各器官明显减小；
雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性 世代。
（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：
（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯 系，而小孢子培养仅需1-2年。
供体亲本 AaBb
花粉
培养
（3）诱变育种中的作用 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能 在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的
纯系。利于筛选隐性突变体 提高诱变效率。
（4） 利于获得优良植株 如：芦笋全雄系的培育 （5）用作基础研究的各个领域
（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径
• 1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂， 形成营养细胞和生殖细胞
接种在平板上的水稻花药
部分花药产生愈伤组织
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
第五节 单倍体植株的鉴定和二 倍化的方法
一、单倍体植株的鉴定
1. 间接鉴定：通过观察染色体倍性变化后而 表现出的容易识别的形态特征等而初步判 断的鉴定方法。 • ①植株形态特征的观察；
• ②叶片气孔保卫细胞的测定；
单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。
单倍体 二倍体
AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb
第十三章 人工诱发单倍体及其应用
第一节 植物单倍体概念及人工 诱发单倍体的应用