山梨醇溶液(1molL,无菌)
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜；2. 取100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
酵母实验文献_实验全过程1
• （选自 共表达_1_3_1_4_葡聚糖酶_省略_酿酒酵母的构建及其性能的应用研 究_鲁健章 浙江大学 博士学位 论文 P60）
酵母感受态制备
1. 将活化的NY—K菌株从平板上接入5mLYPD 液体培养基中，250rpm 30℃过 夜培养。 2. 以0.5%接种量转接至200mL YPD培养基中（为了保证足够的氧气供应，使 用1L 的三角瓶） 摇瓶过夜至1.0—1.3。 3. 3000rpm 4℃下，离心5min，离心，收集细胞沉淀，重悬于200mL冰冷的无 菌水。 4. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于100mL冰冷的无菌水。 5. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于8mL冰冷的1mol/L山 梨醇溶液。 6. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于1mL冰冷的1mol/L山梨 醇溶液。分装，80μl管，即为感受态细胞。-80℃存。 (选自 多基因转化构建重组工业酿酒酵母及其在木薯酒精发酵中的应用研究_ 阳辛凤 海南大学 博士论文 P44)
（选自酿酒酵母生产白藜芦醇关键酶基因4CLcDNA的克隆与转化_王 永智 西北大学 硕士论文 P29）
• 酿酒酵母感受态的制备和转化
1. 挑取酵母 H1246 的单菌落到 10m L 的 YPD 培养基，30℃、180rpm培养 12h。 2. 使用紫外分光光度计测定上述培养物 OD600，转接到 50m L YPD 液体培 养基培养 3h，重新测定培养物的 OD600至 0.4-0.6（不得小于 0.4，否 则 影响转化效率）。 3. 2500rpm 离心菌液 5min，用 40m L 的 1×TE 重悬细胞。 4. 2500rpm 离心 5min 弃上清，加入 2m L 的 1×Li AC/0.5×TE。 5. 室温培养细胞 10min。 6. 接入 10u L 质粒（PYES2-1、PYES2-2、PYES2-3 载体）、10u L 的 10g/L的 ss DNA，上下震荡离心管 5-6 次。 7. 加入 700u L 的 1×Li AC/40%PEG-3350/1×TE，混合均匀。 8. 在 30℃下 200rpm 培养 30min。 9. 加入 88u L DMSO 混合均匀，42℃热激 7 分钟。
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
1mol 山梨醇溶液 相对密度
1mol 山梨醇溶液相对密度下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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10山梨醇检验标准操作规程
山梨醇检验标准操作规程1范围本标准建立了山梨醇的检验标准操作规程。
本标准适用于山梨醇的质量控制与检验。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，其最新版本适用于本标准。
《中华人民共和国药典》 2010版二部《微生物限度检查检验标准操作规程》编号《山梨醇质量标准》编号3职责检验人员、复核人员对实施本标准负责。
4操作规程4.1试剂与试药甘油、氯仿、乙醚、氢氧化钠试液、碘试液、酚酞指示液、氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）、磷酸溶液（1→10）、5%高锰酸钾溶液、10%焦亚硫酸钠溶液、硫酸溶液（3→4）、1%变色酸溶液、标准甲醇溶液、盐酸、高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）、磷酸氢二钠的饱和溶液、高锰酸钾的饱和溶液、1%糠醛溶液、10%氢氧化钠溶液、0.001%丙酮溶液、95%硫酸。
4.2仪器与设备碱式滴定管、50ml具塞量筒、垂熔玻璃漏斗、温度计、水浴锅、比重瓶、蒸发皿、试管、干燥箱、恒温培养箱、比重瓶、干燥器。
4.3检验项目4.3.1性状4.3.1.1操作方法（1）取本品，在明亮光线下，用目测法观察其外观；用鼻闻和口尝其气；并依法观察其特性。
（2）将本品溶于水、乙醇、三氯甲烷或乙醚中，观察溶解情况。
(3) 比旋度取本品约5g，精密称定，置50ml量瓶中，加硼砂6.4g与水适量，振摇使完全溶解，并稀释至刻度（如溶液不澄明，应滤过），依法测定（附录Ⅵ E）。
4.3.1.2记录记录其外观、气味、特性、溶解情况，测比旋度4.3.1.3结果判断（1）本品为白色结晶性粉末；无臭，味甜；有引湿性；（2）在水中易溶，在乙醇中微溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶；（3）比旋度为＋4.00至＋7.00。
判为符合规定。
4.3.2鉴别4.3.2.1 取本品约50mg，加水3ml溶解后，加新制的10%儿茶酚溶液3ml，摇匀，加硫酸6ml，摇匀，即显粉红色。
判为符合规定。
4.3.2.2 本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱集26图）一致。
山梨醇溶液(1molL,无菌)
北京雷根生物技术有限公司
山梨醇溶液(1mol/L,无菌)
简介：
山梨醇(Sorbitol)又称山梨糖醇、己六醇、D －山梨醇等，是一种不挥发多元糖醇。
CAS 号为50-70-4，分子量为182.17。
用于日化行业作为保湿剂、防冻剂等；用于食品行业作为保鲜剂、甜味剂等；用于医药行业作为维生素C 的生产原料等。
Sorbitol solution 用于染色剂的衬染剂、分离细胞核等，经高压灭菌处理。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
1、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 6个月有效。
编号 名称 CS0151 Storage Sorbitol solution(1mol/L,无菌) 100ml RT 使用说明书 1份。
酵母电转化
在精编分子生物学实验指南上有一部分讲到了酿酒酵母，电转化具体过程如下：1）将转化用酵母菌株的单菌落接种于5ml YPD培养基中，30度过夜培养至饱和。
2）转化前一天晚上，在装有500ml YPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，于30度剧烈振摇，直到细胞密度达1*10的8次方（OD600约为1.3-1.5）。
3）于4度4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。
为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4。
如果不需要可接步骤64）加入10ml，pH7.5，10*TE缓冲液，摇晃均匀，再加入10ml10*乙酸锂，旋转摇匀，于30度请请摇动45min5）加入2.5ml 1 mol/L DTT,并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000-6000g于4度离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最终的OD600应为约2007）电转化：在无菌冰冷的微量离心管中加入40ul 酵母菌细胞和小于等于100ng 待转化的DNA（体积小于5ul），混匀。
转移至冰冷的电转槽中，接下来按照你的电穿孔仪的说明操作就可以啦。
8）往电击槽中加入1ml冰冷的1mol/L山梨醇，轻轻吹吸混匀9）直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30度培养3-6天，直到平板上出现菌落。
步骤7-8可能会因电转仪的不同而有所不同。
其实用乙酸锂法也很方便的。
在一本酵母操作的实验手册上还看到了一个lazy-bones的转化实验方法，按照它做下来也得到了菌落。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［ 1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（ Saccharomyces.Cerevisiae ）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主． 1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
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北京雷根生物技术有限公司
山梨醇溶液(1mol/L,无菌)
简介：
山梨醇(Sorbitol)又称山梨糖醇、己六醇、D －山梨醇等，是一种不挥发多元糖醇。
CAS 号为50-70-4，分子量为182.17。
用于日化行业作为保湿剂、防冻剂等；用于食品行业作为保鲜剂、甜味剂等；用于医药行业作为维生素C 的生产原料等。
Leagene Sorbitol solution 用于染色剂的衬染剂、分离细胞核等，经高压灭菌处理。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
注意事项：
1、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 6个月有效。
相：
编号 名称 CS0151 Storage Sorbitol solution(1mol/L,无菌) 100ml 4℃ 使用说明书 1份 编号 名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
CS0001 ACK 红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer)
CZ0063 改良台氏液(Tyrode's solution)
DG0005 糖原PAS 染色液
NA0030 Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE)
NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0)
TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。