植物叶绿体色素含量的测定(沈)
叶绿体色素的提取与分离、理化性质及含量测定 3
叶绿体色素提取分离与理化性质及含量测定▪（一）实验目的及意义▪（二）实验原理▪（三）实验步骤▪（四）实验报告实验目的和意义▪绿色植物的光合作用是在叶绿体中的叶绿体色素中进行的，了解叶绿体色素的组成、性质及测定对于理解光合作用的本质很有帮助。
▪因此，测定叶绿素含量便成为研究光合作用与氮代谢必不可少的手段，在作物育种、科学施肥、看叶诊断中有着广泛的应用叶绿体在细胞中运动视频叶绿体在细胞中的分布与结构类囊体膜的结构及功能实验原理植物叶绿体色素是吸收太阳光能，进行光合作用的重要物质。
它一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
实验原理▪色素分离的方法有多种，纸层析是最简便的一种。
当溶剂（有机推动剂）不断从纸上流过时，由于混合物（叶绿素提取液）中各种成分在固定相（滤纸纤维素所吸附的水分）和流动相（有机推动剂）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。
▪叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
实验原理▪叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
▪叶绿素中的镁可以被氢离子所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验步骤(1)▪根据朗伯一比尔定律，某有色溶液的吸光度D与其中溶液浓度C和液层厚度L成正比，即：▪D＝KCL▪D：吸光度，即吸收光的量，C：溶液浓度, K：为比吸收系数（吸光系数），L：液层厚度，通常为1cm.▪如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。
植物叶绿体色素含量的测定(沈)
材料鲜重（g）*1000
2. 比较分析不同营养处理的植物叶绿素含量差 异及其Chla/Chlb差异
• 实验要点：
• 1、研磨要在弱光下进行，且速度要快； • 2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿 素； • 3、残渣中的色素要充分洗脱； • 4、波长要调准； • 5、比色液不能混浊。
六、思考题
• 1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否
叶绿体色素的含量是植物生长状态的一个反映， 等都可以影响叶绿体色素的含量与组成，并因
之影响植物的光合速率。
二、实验原理
叶 绿 体 色 素 组 成
叶绿素a：吡咯环Ⅱ-CH3
叶绿素b：吡咯环Ⅱ-CHO
Mg2+
叶黄素：3,3’-OH
胡罗卜素： 3,3’-H
叶绿素是双羧酸的酯，一个 羧基被甲醇所酯化 ，另一个 羧基被叶绿醇所酯化。 叶绿素a与b的不同之处是叶 绿素a比b多两个氢少一个氧。 两者结构上的差别仅在于叶 绿素a的第Ⅱ吡咯环上一个甲 基(－CH3)被醛基(－CHO)所取 代。
叶绿素分子含有 一个卟啉环的“头部” 和一个叶绿醇(植醇) 的“尾巴”。
高 等 植 物 叶 绿 体 色 素
叶绿素
叶绿素b---C55H70O6N4Mg
叶绿素a---C55H72O5N4Mg
胡萝卜素---C40H56 叶黄素---C40H56O
类胡萝卜
这两类色素均不溶于水，而溶于含有水 的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙 酮提取，叶绿体色素易受光氧化，提取色
用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定 量分析？为什么？ • 2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80 ％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无 水丙酮或乙醇提取？
素应在弱光中进行，并避光保存色素
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。
研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。
本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。
材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。
方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。
2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。
3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。
4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。
5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。
6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。
7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。
加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。
加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。
通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。
叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。
这种反应也证实了叶绿体的存在。
叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。
叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。
乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。
这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。
实验5、叶绿体色素的提取及含量测定
思考题
• 1、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮， 而新鲜的材料可以用无水丙酮提取? • 2、叶绿素的提取中加入碳酸钙、石英砂各有什么作 用？ • 3 、叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一 吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
实验5 叶绿体色素的提取与含量测定
一、目的
掌握叶绿体色素的提取方法与含量测定方法
二、原理
1、提取原理：叶绿体色素是酯类化合物均不溶
于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％
的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水
Байду номын сангаас
的混合液提取。叶绿体色素易受光氧化，提取
色素应在弱光中进行，并避光保存色素。新鲜 的叶片可用无水丙酮提取。叶干粉用85％丙酮 提取。
• 四、结果计算 • 求得色素的浓度后再按下式计算组织中各 色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿 体色素的毫克数表示）： • （ mg/g ）
• [ 注意事项 ] • 1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研 磨时间应尽量短些。 2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长 下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消 光度值的 5 ％，否则应重新过滤。 • 3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长 精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ， 则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用 前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器 说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。4. 在使用 低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定 叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差， 单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值 偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此， 使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校 正。
实验二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法
二、植物叶绿素含量测定----丙酮提取法高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。
叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。
叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。
在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。
叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。
[原理]叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。
叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。
利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
其数学表达式为：A=Kbc式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。
叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。
叶绿素a和b 在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。
根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（C a、C b、C a十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示：A663=82.04C a+9.27C b （1）A645=16.76C a+45.60C b（2）解方程（1）和（2）得：C a=12.7 A663—2.59 A645 (3)C b=22.9 A645—4.67 A663(4)C a十b＝20.3 A645—8.04 A663(5)从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。
叶绿素测定分光光度法
叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素含量的测定——分光光度法叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰。
因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度，根据经验公式即可计算出色素溶液中各色素浓度，不同溶剂所提取的色素吸收光谱有差异，因此，应使用不同的计算公式。
叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂。
叶绿体色素80 ％丙酮提取液中叶绿素a 和 b 及类胡萝卜素分别在663nm 、646nm 和470nm 波长下有最大吸收峰，而95 ％乙醇提取液中它们则在665nm 石49nm 和470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素丙酮（或乙醇）提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量。
[ 实验目的]掌握分光光度法对植物叶绿体色素提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度测定与计算方法，以及植物材料中各种色素含量的求算方法。
[ 器材和试剂]1 ．植物材料新鲜（或烘干）植物叶片，如菠菜叶片等。
2 ．实验器材分光光度计、天平、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、棕色容量瓶、吸水纸、擦镜纸和滴管。
3 ．实验试剂80 ％丙酮（或95 ％乙醇）、石英砂和碳酸钙粉。
[ 操作步骤］1 ．色素的提取①称取新鲜（或干材料）的洗净擦于的植物叶片0.5g （或一定面积），去中脉、剪碎后放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml80 ％丙酮（或95 ％乙醇），冰浴中研磨至组织变白，再加丙酮10ml ，研成匀浆，暗处静置约10m in 。
②将提取液过滤到50 ml 棕色容量瓶中，用丙酮反复冲洗研体与研棒数次并用少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，以使色素全部转移入容量瓶。
最后用丙酮定容至50 ml ，摇匀，并保存于暗处备用待测。
(2021年整理)叶绿体色素含量的测定
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叶绿体色素含量的测定---—分光光度法中文摘要：本实验利用菠菜叶作为原料用80%的丙酮提取叶绿体色素，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度,带入公式计算出色素溶液中各色素浓度。
英文摘要：In this experiment ， we used spinach leaves as raw material and used 80％ of acetone to extract pigments from them ,and apply spectrophotometer at a particular wavelength to determine absorbance, then take the absorbance into the formula to calculate concentration of each pigment。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2.皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
3.取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。
4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
透射光下呈绿色，反射光下呈红色。
5.光谱分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。
b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。
2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。
观察颜色变化。
2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。