谷氨酰胺发酵调控
氨基酸发酵
｜
｜
和 嘧 啶 的 前 体 物 ， 尤 其 是 AT P ， 它 还 直 接
参与组氨酸的合成，所以利用嘌呤的结构 类似物抗性突变株解除反馈调节可以达到 增加组氨酸前体物的积累。
途径也能增加HMP途径的流量。
5． HMP途径的阻断 由于合成组氨酸需要HMP途径的中间代谢产物， 所以完整的HMP途径会减少D-核糖的生成，通过 阻断转酮酶来破坏完整的HMP途径，从而使代谢
谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是保证α -酮戊二酸向 谷氨酰胺而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向代谢的 关键酶。同时在该循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨 酸、缬氨酸的分支代谢，设法减弱分支代谢而强化主 流代谢，主要的方法是减弱催化这些分支代谢酶的酶 活。
3
谷氨酰胺发酵
｜
谷氨酰胺合成酶的最佳pH为 6.5 ～ 7.0 ， 而 谷 氨 酰 胺 酶 、 N- 乙 酰 谷 氨 酰 胺 脱 乙 酰 酶 的
1
丙氨酸发酵 丙 氨 酸白
1
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋 质 的 20 种 氨 基 酸 之 一 。 它 的 分 子 式 是
｜
｜
(alanine) C3H7NO2 ， 有 α - 丙 氨 酸 和 β- 丙 氨 酸 两 种 同 分
异构体。
2
功能
预防肾结石、协 助葡萄糖的代谢， 有助缓和低血糖， 改善身体能量。
3
用途
用于合成新型甜 味剂及某些手性 药物中间体的原 料。 点石演示
简介
点石演示
点石演示
1
丙氨酸发酵
｜
73% 93% 80% 78%
｜
丙氨酸性状
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位， 是组成人体蛋白质的20种氨基酸
谷氨酰胺代谢调控
H
H
改良方法
• 对于有机杂酸：可以通过调节溶 氧水平来消除； • 对于非目的氨基酸：可以采取筛 选营养缺陷型或适当添加相应氨 基酸的方法来减弱。
H
2.3.1 葡萄糖浓度 Gln的转化随着葡萄糖的加入量的增加而提高， 但从能量偶联效率来讲，葡萄糖的利用率却随 葡萄糖的加入量的增加在降低。因此，从经济 方面讲，提高葡萄糖的添加量并不是提高Gln 转化量的有效途径。 2.3.2谷氨酸浓度 补加Cl-能影响细胞膜的透性，使谷氨酸不易 渗出，而转化为谷氨酰胺分泌出来
H
2.1.1谷氨酰胺合成酶（GS）的效能的调节 硫氨酸亚砜(MsO)是谷氨酰胺的结构类似物，很 容易被GS误认而与其变构部位结合抑制其活性。
针对这一现像，我们可以使用甲硫氨酸亚砜 (MsO)作为筛选剂选育突变株。从代谢角度解除 了因谷氨酰胺的积累而造成的对GS的反馈抑 制．
H
GS的存在形式：未修饰、经腺苷共价修饰的。 AMP 共价键 酪氨酸残基 GS(AMP) 腺苷酰基转移酶(Adenylyltransferase，Atase) 腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失 铵浓度 铵盐↑ 腺苷酰化程度↑ GS酶活力↓ 因此我们可以利用重叠引物法将GS结构基因的 Tyr405突变为Phe405从而除去GS腺苷酰化位点。
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策划：林骥晗、王蒙、刘一凡 资料：卢霄崎、杨帆 整理：林骥晗 制作：杨瀛、邢桦彬 展示：刘一凡 茶水：王瀚泽、，毛新宇、甘海威 托儿：王蒙
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可以看出Gln转化量随Glu浓 度的增加而有所提高。这可 能是由于谷氨酰胺合成酶的 分子结构所致:Glu进人酶活 性中心部位很困难。而高浓 度的Glu则会增加或加快其进 入到酶活性中心部位，促进 酶催化反应。但从如图4中也 能看到Gln转化率却随着Glu 浓度的增加而下降。
4谷氨酸发酵控制
由于各种微生物所具有的酶系不同，所 能利用的碳源往往是不同的。目前所发现的 谷氨酸产生菌均不能直接利用淀粉，只有利 用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖等单糖或双 糖，有些菌种能够利用醋酸、乙醇、正烷烃 等。由于国内绝大多数味精厂采用的碳源为 淀粉水解糖，因此这里主要介绍淀粉水解糖 作业碳源的发酵。
培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影 响。在一定范围内，谷氨酸产酸率随糖浓 度增加而增加，但当糖浓度过高时，由于 渗透压增大，对菌体生长和发酵均不利， 当工艺条件配合不当时，糖酸转化率相当 低。同时培养基浓度大，氧溶解的阻力也 增大，影响供氧效率。
由于双酶法（高温淀粉酶液化、糖化 酶水解）对原料中生物素等营养因子破坏 很少，因此采用双酶法制糖时，如果采用 生物素亚适量工艺进行谷氨酸发酵，尽量 采用精制淀粉。
4.1.2 氮源
氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物 质和合成谷氨酸氨基的来源。同时，在发酵 过程中一部分氨用于调节发酵液pH，形成谷 氨酸铵。因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一 般的发酵工业要高，一般发酵工业碳氮比为 100: 0.2～2.0，而谷氨酸发酵的碳氮比为 100: 15～30。
磷酸盐对谷氨酸发酵影响很大。当磷 酸盐偏高时，菌体代谢转向合成缬氨酸； 但如磷酸盐过低，菌体生长也不好，造成 延长发酵时间，影响谷氨酸的合成。
②硫酸镁 Mg2+许多重要酶(如己糖磷酸化酶、异柠 檬酸脱氢酶、羧化酶等)的激活剂。如果Mg2+ 含量太少，就会影响其底物的氧化。一般革 兰氏阳性菌对Mg2+的最低要求为25mg/L；革 兰氏阴性菌为4～5mg/L。 MgSO4· 2O中含Mg2+ 9.87%，发酵培 7H 养基中添加0.5g/L MgSO4· 2O时，Mg2+浓 7H 度约为50mg/L。
谷氨酰胺合成酶的基因表达和谷氨酰胺代谢途径的定向进化
中山大学硕士学位论文谷氨酰胺合成酶的基因表达和谷氨酰胺代谢途径的定向进化姓名：杜云平申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：刘建忠20070607 中山大学２００７届硕士学位论文杜云平了定向进化。
经亚硝基胍（ＮＴＧ）和紫外线诱变后，选用谷氨酰胺的结构类似物磺胺胍（ｓＧ）以及硫酸铵（（ＮＨ，）：Ｓ０，）筛选出四株具有两重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株（产量分别为３１．３４９／Ｌ，３０．２８９／Ｌ，３０．６２ｇ／Ｌ和３１．８１ｇ／Ｌ）。
然后在青霉素Ｇ为０．６Ｕ，处理３ｈ的条件下去除谷氨酸棒杆菌的细胞壁，运用原生质体融合技术使具有不同正突变的多个全基因组进行随机重组。
经三轮的基因组重排，谷氨酰胺的产量达到４７．３５ｇ／Ｌ，提高４８．８５％，菌株命名为ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ．ＳＨＵ３。
最后，我们对所获菌株：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－（ｉＳ和ＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ．ＳＨＵ３进行了５．Ｌ发酵罐的发酵实验。
在采用搅拌速率为８５０ｒｐｍ，通气量为１．５ＶＶＭ的条件下和初期脲量为１．５ｇ／Ｌ（摇瓶初脲量的３０％），在发酵中后期流加４５％的尿素达到控制ｐＨ维持在６．２左右，同时达到补充氮源的双重目的。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－Ｘ１０９Ｅ－ＧＳ５－Ｌ发酵产量提高到６３．００ｇ／Ｌ，发酵周期缩短为２８ｈ，产率为２．Ｌ．２５ｇ．１／ｈ。
而ＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ＝ＳＨＵ３发酵产量提高到７４．８２９／Ｌ，发酵周期缩短为３６ｈ，产率为２．０８舀Ｌ．１／ｌＩ。
关键词：谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合成酶定向进化表达基因组重排Ⅱ中山大学２００７届硕士学位论文杜云平ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅａｎｄｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＵＴＨＯＲ：ＹＵＮ．ＰＩＮＧＤＵＳＵＰＥＲⅥＯＲ：ＡＳＳＯＣＵⅡ１ＥＰｒｏｆ．Ｊ¨蝌．ＺＨＯＮＧＵＵ心ＯＲ：ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＬ－Ｇｈｔａｍｉｎｅ（Ｌ－Ｇｈ）ｗａｓａｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｍａｉｎｌｙｕｓｅｄｔｏｃｕｒｅｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｉｇｅｓｔｉｖｅｕｌｃｅｒａｎｄｔｈｅｂｒａｉｎｎｅｒｖｅａｓｏｎｅｋｉｎｄｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｎｕｔｒｉｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｉｎｃｅ１９７７，ＧｌｕｔａｍｉｎｅｈａｄｂｅｅｎｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎＪａｐａｎａｎｄＫｏｒｅａ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｈａｄｒｅａｃｈｅｄｔｏ６０９．Ｌ－１ｉｎＪａｐａｎａｎｄ５０ｇ．Ｌ１ｉｎＫｏｒｅａｓｉｎｃｅｔｈｅｍｉｄｄｌｅｏｆ１９９０ｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｃｏｕｌｄｎｏｔｒｅａｃｈａｔｔｈｅｓｅｌｅｖｅｌｓｉｎＣｈｉｎａ．Ｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙ，ａｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）ｇｅｎｅ，ｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｈｔａｍｉｎｅ．Ｆｉｒｓｔｏｆａｌｌ，ｗｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｇＧＳｇｅｎｅｂｙＰＣＲａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｗｈｏｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｇｈｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｇｅｎｅｏｆＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＪａｋｏｂｙ．ＡｆｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｉｎｔｏｔｈｅｖｅｃｔｏｒｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ，ｔｈｅⅢ中山大学２００７届硕士学位论文牡云平ｒｅｓｕｌｔａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｆｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆ３％ｇｌｙｃｉｎｅａｎｄ２．５ｈｐｒｅ·ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｔｗｏａｄｄｉｔｉｏｎａｌｆｒｅｅｚｅ／ｔｈａｗｃｙｃｌｅｓｏｆｃｅｌｌｓ，ｐｒｉｏｒｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｗｈｅｎｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅｒｅａｃｈｅｄａｔ２４ｈ，ｗｅａｄｄｅｄ０．５ｍＭＩＰＴＧｆｏｒｉｎｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＳｇｅｎｅ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄｕｐｔｏ２６４％．ＴｈｉｓｂａｃｔｅｒｉｕｍｗａｓｎａｍｅｄＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ—ＸＫ９９Ｅ－ＧＳ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｉｎＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＷａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｏｓｔｌｙｇｒｏｗｎｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆ０．６ＵｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧｆｏｒ３ｈｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｔｈｅｃｅｌｌｗａｌｌｂｅｆｏｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｌｙｓｏｚｙｍｅ．ＴｈｅｎｗｅｆｕｓｅｄｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｗｉｔｈｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆ３１．３４ｇ／Ｌ，３０．２８ｇ／Ｌ，３０．６２ｇ／Ｌａｎｄ３１．８１ｇ／Ｌ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ａｆｔｅｒｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｇｅｎｏｍｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅａｃｈｅｄｔｏ４７．３５ｇ／ＬａｎｄＷａｓｅｎｈａｎｃｅｄｕｐｔｏ４８．８５％．ＴｈｉｓｂａｃｔｅｒｉｕｍＷａｓｎａｍｅｄＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ—ＳＨＵ３．Ｌａｓｔｂｕｔｎｏｔｌｅａｓｔ，ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｅｓｏｆｇｌｕｔａｍｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－ＧＳａｎｄＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ—ＳＨＵ３ｉｎｔｈｅ５一Ｌｆｅｒｍｅｎｔｏｒｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＴｏｃｏｎｔｒｏｌｐＨｉｎｔｈｅｌａｔｅａｇｅｏｆＩＶ中山大学２００７届硕士学位论文杜云平ｐｒｏｃｅｓｓｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｌａｙｅｄａｌｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｇｌｕｔａｍｉｎｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．ＷｈｅｎｐＨｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄａｔａｂｏｕｔ６．２ｂｙｆｅｅｄｉｎｇ４５％ｕｒｅａａｆｔｅｒｉｔｎａｔｕｒａｌｌｙｄｒｏｐｐｅｄｔｏｔｈｉｓｐＨ，ｇｌｕｕａｍ〕ｉｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｒｅａｃｈｅｄｔｏ６３．００ｇ／ＬｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ—ＧＳａｎｄ７４．８２ｇ／ＬｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ－ＳＨＵ３．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ’ｔｈｅｔｉｍｅｓｆｏｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄｆｒｏｍ５０ｈｏｕｒｓｉｎｔｈｅＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒｆｌａｓｋｔｏ２８ｈｏｕｒｓｉｎＣｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ－ＧＳａｎｄ３６ｈｏｕｒｓｉｎＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＧ－ＳＨＵ３．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ，Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｇｌｕｔａｍｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳ）。
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化
植物乳杆菌Lp-G18谷氨酰胺合成酶活力发酵工艺优化徐煜;蒋德意;韩迪【摘要】植物乳杆菌是一种具有多种生物活性的益生菌,其中缓解肌肉疲劳和损伤能力的运动保健功能引起了市场的关注,这与其谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的活力相关,目前尚缺乏对植物乳杆菌GS发酵工艺研究的报道.通过在培养基中添加L-谷氨酸、调整碳源以及改变金属离子质量浓度等方式提高植物乳杆菌Lp-G18发酵后的GS活力.得到优化培养基组成为:葡萄糖40 g/L(222 mmol/L)、七水硫酸镁4.92 g/L(20 mmol/L)、一水硫酸锰0.025 g/L、L-谷氨酸8.82 g/L(60 mmol/L)、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母膏5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二胺2 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-801 g/L.采用优化培养基发酵得到的GS活力比原基础MRS培养基培养条件下的酶活力提高了1.4倍.【期刊名称】《乳业科学与技术》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P13-17)【关键词】植物乳杆菌;谷氨酰胺;合成酶活力;发酵【作者】徐煜;蒋德意;韩迪【作者单位】润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436;润盈生物工程(上海)有限公司,上海 200436【正文语种】中文【中图分类】TS252.1乳杆菌是一类传统的、普遍被认为安全的益生菌，在酸乳、饮料、菌粉或泡菜中都有使用[1] 。
植物乳杆菌是常见的益生菌之一，具有良好的耐酸、耐胆盐能力，并具有许多益生功能，如调节肠道健康、抗氧化、抗真菌、预防便秘和腹泻、防治上呼吸道感染、抑制致病菌侵入和调节人体免疫等作用[2] 。
同时，植物乳杆菌还具有运动保健功能，具有缓解肌肉疲劳和损伤的能力[3] 。
植物乳杆菌缓解肌肉疲劳及损伤的能力与其谷氨酰胺的合成能力相关。
谷氨酰胺研究进展
谷氨酰胺研究进展L-谷氨酰胺( Gln)是由L-谷氨酸和氨化合而成的, 与谷氨酸一样也是20种氨基酸中的一种。
1883年Schulze从甜菜汁中发现了Gln。
后来又先后从发芽种子及蛋白质中检出。
1935 年, Hans Kerbs首次发现哺乳动物肾脏合成和分解L-Gln的能力, 人们开始逐渐了解它的作用。
并在随后的研究中, Kerbs强调多数氨基酸都有多种功能, 但L-Gln的功能是最丰富的。
1955年, Harry Eagle综述了哺乳动物细胞的G ln营养需要, 并强调了它是一种很重要的营养素。
近年来, 随着人们对L-Gln的生理、生化、临床等方面研究的深入和发展,Gln对生命的重要性正日渐突出, 被认为是目前所知道的最重要的氨基酸之一, 并被称之为条件性必需氨基酸, 也是一种极有发展前途的新药。
L-谷氨酰胺的理化性质L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)是L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种条件性必需氨基酸（图1），相对分子质量146.15，熔点185℃(分解)，晶体呈白色斜方或粉末状，结晶状态下稳定，无臭，稍有甜味，溶于水(水溶液呈酸性) ，等电点5.65，几乎不溶于乙醇和乙醚。
L-Gln 属中性氨基酸，在偏酸、偏碱及较高温度下易分解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸。
图1 L-谷氨酰胺分子结构L-谷氨酰胺的生理特性L-谷氨酰胺是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一, 是机体含量最丰富的氨基酸, 占全部游离氨基酸60%以上，主要储存在脑、骨骼肌和血液中, 具有很广泛的生理作用: (1)维持机体免疫功能。
现有资料表明谷氨酰胺不仅是淋巴细胞和巨噬细胞的重要能量物质, 甚至可能是各种免疫细胞的主要能源物质。
小肠作为人体重要的最大免疫器官, 是利用L-谷氨酰胺的主要器官, 它的吸收细胞以很高的速率利用谷氨酰胺, 说明谷氨酰胺在机体免疫中发挥着十分重要的作用。
(2)调节蛋白质的合成和分解。
谷氨酰胺是蛋白质合成的重要调节剂, 在运动中可以调节蛋白质合成和降低肌肉蛋白质的分解, 从而维持机体的生理功能。
谷氨酸发酵影响因素及控制
生物素对菌体细胞膜通透性的影响
谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物 素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通 过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性 的调节。
生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的 主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的， 当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个 细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径 如下：
谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵 发酵过程中，谷氨酸的大量积累不是
由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢 调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及 发酵条件的适合。
整个发酵过程可简单的分为2个阶段: 第1阶段是菌体生长阶段; 第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累
。
第二节 影响谷氨酸产量的因素及发酵条件控制
NH4+不足：不利于-酮戊二酸的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节
影响因素3：NH4+浓度
NH4+的供给方式（流加）： （1）液氨 （2）0.8%尿素
影响因素氨酸的产量随糖含量的增加而增加 ，但糖含量过高，渗透压过大，对菌体生长不利， 谷氨酸对糖的转化率低。
我国使用的生产菌株：
北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense) AS1.299
北京棒杆菌D110
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) AS1.542
棒杆菌(Corynebacterium sp.)S-914 黄色短杆菌T6~13
生产菌株特点
在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外 ，虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有 一些共同特点: 1. 革兰氏阳性 2. 菌体为球形、短杆至棒状 3. 不形成芽孢 4. 没有鞭毛，不能运动 5. 需要生物素作为生长因子 6. 在通气条件下才能产生谷氨酸。
氨基酸类药物的发酵生产—谷氨酸的发酵生产
生物素的来源：氨基酸生产上可以作为生物素来源的原料 有玉米浆、麸皮水解液、糖蜜及酵母水解液等，通常选取 几种混合使用。例如，许多工厂选择纯生物素、玉米浆、 糖蜜这三种物质来配制培养基。各种原料来源及加工工艺 不同，所含生物素的量不同。玉米浆含生物素500μg/kg， 麸皮含生物素300μg/kg，甘蔗糖蜜含生物素1500μg/kg。
操作简单 周期长，占地面积大。
直接常温等电点法工艺流程
发酵液
起晶中和点（pH4-4.5) 育晶（2h）
盐酸
菌体及细小的 谷氨酸晶体
等电点搅拌pH3-3.22 静置沉降4-6h 离心分离
成品
母液
干燥
湿谷氨酸晶体
2、离子交换法
可用阳离子交换树脂来提取吸附在树脂上的谷氨 酸阳离子，并可用热碱液洗脱下来，收集谷氨酸 洗脱流分，经冷却、加盐酸调pH 3.0～3.2进行结 晶，之后再用离心机分离即可得谷呈棒形或短杆形； 革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢；不能运动； 需氧性的微生物； 生物素缺陷型； 脲酶强阳性； 不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；
发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变； 二氧化碳固定反应酶系强； 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱； α-酮戊二酸氧化能力微弱； 柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活
有机氮丰富有利于长菌，因此谷氨酸发酵前期要 求一定量的有机氮，通常在基础培养基中加入适 量的有机氮，在发酵过程中流加尿素、液氨或氨 水来补充无机氮。
（3）无机盐
磷酸盐 ：工业生产上可用K2HPO4·3H2O、KH2PO4、 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。 过高：代谢转向合成缬氨酸。 过低：菌体生长缓慢。
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• Yamamoto等从腐臭假单胞菌 (Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺 合成酶基因Y-30，导入大肠杆菌中进行克 隆表达，其表达量是Pseudomonas taetrolens中的30倍。
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1.3 pH对谷氨酰胺发酵的影响
pH主要影响酶的活性 和菌的代谢
在中性和微碱性条件 下（PH7.0-8.0）积 累谷氨酸，在酸性条 件下积累谷氨酰胺
Байду номын сангаас
• 发酵前期应控制pH值在偏碱性环境，以促进菌体 生长，并激活谷氨酸合成酶的活性，保证谷氨酰 胺合成前体谷氨酸的合成； • 发酵后期应控制pH值在偏酸性环境，以增加谷氨 酰胺合成酶的活性，同时抑制谷氨酰胺酶的活性 ，使谷氨酰胺大量积累生成，而减少谷氨酸的生 成量。
• GS的表达易受到高浓度铵盐的阻遏，氮源 的一次性补加也容易导致谷氨酰胺合成酶 活性急剧下降；在铵盐不足时，GS表达量 就会增加，所以氮饥饿处理可以提高中GS 的表达量，梯度补加氮源也可以尽量减少 GS活力的快速丧失。
1.1 氮源
• 氮饥饿处理
• 李春等为了解决高浓度铵盐阻遏谷氨酰胺合成酶 表达与谷氨酰胺合成需要过量铵之间的矛盾，提 出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略， 提高了谷氨酰胺的产量，最高可达2.19%，比原 位氮饥饿工艺提高了近72%，比未经过氮饥饿处 理的旧工艺提高了近200% 。
• （1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它受天冬氨酸的反馈抑 制； • （2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨 酸、ATP的反馈抑制； • （3）丙酮酸脱氢酶系，该酶是催化不可逆反应的酶，受 乙酰CoA 、NADH、GTP的反馈抑制；
• （4）异柠檬酸脱氢酶，ADP和NADH 抑制此酶的活性； • （5）Glu脱氢酶和（6）GLn合成酶，此二酶是保证α-酮 戊二酸向GLu而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向的关键 。同时在此循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸 的分枝代谢，我们设法减弱分枝代谢而强化主流代谢，主 要的方法是减弱催化这些分枝代谢的酶。
谷氨酸 脱氢酶
NH4+浓度
谷氨酰 胺合成 酶
谷氨酸 合酶
GOGAT
Tesch在谷氨酸棒杆菌(CorynebaCterium glutamicum) 中研究了NH4+浓度对GDH、GS、GOGAT活性的影 响，结果如下： • NH4+浓度增加时，GDH活性基本没有发生变化； • NH4+浓度大于10mmol／L时，GS、GoGAT活性小 于1 mmol／L的10％，即分别低于110U／mg蛋白、 42U／mg蛋白； • 发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取 NH4+的第一步反应。此研究结果为梯度补氮生产LGln提供了理论基础。
• 陈奎发等设计了在线氮饥饿处理的发酵过程；在 限制初始氮源浓度的条件下，菌体在生长后期自 然进入氮饥饿状态，GS酶表达量增加，此后再提 供充足的铵盐，提高L-Gln的合成能力，结果使LGln的产量提高了69％，达到11.5 g／L，菌体内 谷氨酰胺合成酶活性提高了2倍以上。
1.2 金属离子
• 为了提高谷氨酰胺的产量，金属离子特别 是Zn2+、Mg2+和Mn2+的供给是必要的。 • Zn2+对谷氨酰胺合成酶具有刺激作用，同 时Zn2+还可增强NH4Cl对谷氨酰胺酶的抑制 作用，使其不能分解谷氨酰胺。
• 中村纯等人通过敲除细菌染色体上的谷氨 酸合酶基因的方法降低细胞内谷氨酸合酶 活性,来减少谷氨酰胺的分解; • 通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝 数和修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译 控制区,来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达, 促使菌体内积累更多的谷氨酰胺。
• 郑强等进行glnA基因的克隆与过量表达，利用谷 氨酸棒杆菌发酵过程产生的谷氨酸为底物，在 glnA基因表达的GS酶的催化下，诱导后的重组 茵发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍，培 养基质中的铵盐反应生成L-谷氨酰胺，理论上可 以节约添加谷氨酸的成本。
谷氨酰胺合成酶突变基因
• 谷氨酰胺合成酶／谷氨酸合酶(GS／GOGAT)体 系是由铵离子浓度调节的，在较低铵离子浓度下 发挥作用，在高铵离子浓度条件下受抑制。 • 谷氨酰胺合成酶的调节开关是在其肽链405位置 的酪氨酸被定点突变为苯丙氨酸，从而失去了这 种调节机制，使得谷氨酰胺合成酶可以在高铵离 子条件下发挥催化功能，将谷氨酸转化为谷氨酰 胺。
谷氨酰胺的发酵控制 /JDPP T
1
发酵条件控制 代谢途径调控
2
4
右图是谷氨酰胺发 酵工艺图 L-谷氨酰胺是在谷 氨酸发酵工艺基础 上，在谷氨酰胺合 成酶作用下生产L谷氨酰胺。
谷氨酰胺
采用谷氨酸生产菌,可以实现谷氨酸发酵转向谷氨酰 胺发酵。发酵转换的条件是: 一、发酵培养基中有高浓度的铵盐存在,其含氮量比 谷氮酸发酵时所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成 酶的催化下,由谷氨酸进一步合成为谷氨酸胺； 二、菌体增殖进入平衡期后,发酵pH值必须调整到 6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被 分解成谷氨酸。
1.4 供氧对谷氨酰胺发酵的影响
• 氨基酸发酵过程中，供氧不足会积累乳酸 等副产物，菌体减少。 • 通过通气搅拌增加溶氧量。
生产谷氨酰胺条件
影响细胞 膜通透性
二 代谢途径调控
天津短杆菌株合成谷 氨酰胺的主流代谢中， 有几个关键酶控制其 强度，这几个酶分别 受不同代谢物的反馈 调节，活化这些酶有 利于L-GLn的生物合 成。
生物合成途径中关键酶的调控
• 陈国强等人重组了一株含有透颤菌血红蛋白基 因vgb和谷氨酰胺合成酶突变基因glnA’的野 生谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC14067， 可以实现在较低溶氧量水平，较低成本下，生 产较高产量的谷氨酰胺。
• vgb是编码细菌中血红素蛋白(VHb)的基因 ，VHb是以氧合态参与和氧有关的代谢，通 过将氧传递给呼吸链，而调节末端氧化酶 的活性，改变氧化磷酸化的效率，进而改 变低氧条件下的代谢途径，从分子水平上 提高重组菌对氧气的利用能力，为解决谷 氨酰胺大规模生产过程中要求高溶氧的问 题提供了一个想法。
谷氨酰胺合成机理
发酵条件的变更，谷氨 酸产生菌中的谷氨酰胺 合成酶活力增加，而谷 氨酸合酶活力受到抑制 Text in here 由于细胞环境的影响， 谷氨酰胺易从细胞中分泌 出来积累在发酵液中， 而谷氨酸渗透性减小(滞 留在细胞内)
谷氨酰 胺积累
谷氨酸
谷氨酰胺
1 发酵条件控制
L-谷氨酰胺生物合成是在谷氨酰胺合 成酶(glutamine synthetase， GS)催 化下进行的，所以发酵法生产L-Gln的 关键在于调控GS酶活性。