常见荧光素
常见的荧光量子产率标准物
常见的荧光量子产率标准物
荧光量子产率是指在光激发下，发射出荧光的分子数量与吸收入激发态的光子数量之比。
这个比值通常以百分比表示。
对于不同的荧光染料和荧光物质，其荧光量子产率可能有很大的差异。
以下是一些常见的荧光标准物质和它们的荧光量子产率：
1.荧光素（Fluorescein）：
•荧光量子产率：约80%
2.罗丹明B（Rhodamine B）：
•荧光量子产率：约80%
3.吡啶（Pyridine）：
•荧光量子产率：约50%
4.奎宁（Quinine）：
•荧光量子产率：约54%
5.硫化苯（Benzene Sulfur）：
•荧光量子产率：约1%
6.铝酞菁（Aluminum Phthalocyanine）：
•荧光量子产率：约15-20%
需要注意的是，荧光量子产率受到多种因素的影响，包括溶剂、温度、化学环境等。
上述数值是在特定实验条件下测得的标准值，实际应用中可能因条件不同而有所变化。
研究人员通常使用这些标准物质来校准和比较不同荧光物质的性能。
在实验和应用中，了解荧光量子产率对于正确选择和使用荧光染
料至关重要。
几种常见荧光素极其特性介绍
荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。
4、其它荧光素
单激光束三色荧光分析时，要求单激光激发，所选择的三种荧光素的发射光波长应该有所不同。除FITC（发射绿光）、PE（发射橙光）外，还应选择发射红光或深红光的藻红蛋白－花青素（phycoerythrin and cyanidinPC5)、叶绿素蛋白（peridinin chorophyll protein，PerCP）或藻红蛋白－德克萨斯红（phycoerythrin and Texas Red tandem，ECD）。因为这些荧光素在受到488nm的蓝光激发CD是由在空间结构上互补的两个荧光素分子通过共价键结合而成，组成一个荧光分子。PC5由PE和cyanidin 5组成，ECD由PE和Texas Red组成。他们前一个分子的发射光波谱与后一个分子的激发光波谱相重合，这样，当前一个分子受激光激发后，产生的发射光可直接激发后一个分子，最后由后一个分子的发射光体现出整个组合的荧光特性。因此，此组成上说是两个分子，但表现为一个分子的物理性质。
（2）PerCP是从一种生活于深海区域的鞭毛虫中发现的色素，其功能为将可渗透入深海的落光传递至鞭毛虫的叶绿素发色基团，进而发出红光。需注意的是PerCP为单个分子。
（3）别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）和花青素5（cyanidin 5，Cy5）这两种荧光素的激发光波长要求在630nm左右，需第二根激光来激发。
间接免疫荧光试验
荧光。 6）其它：酶作用后产生荧光物质。
2021/4/4
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三、分类
直接免疫荧光法 间接免疫荧光法
2021/4/4
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四、应用
将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制， 待病价最高的时候进行间接荧光免疫实 验
用于分毒时，确定有无病毒的存在 测抗体
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二、常见荧光素特性
1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。
3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。
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谢谢！
2021/4/4
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感谢您的阅读收藏，谢谢！
2021/4/4
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间接荧光免疫实验
2013307341 叶苹苹
2021/4/4
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一、原理
根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原 或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用 这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查 细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细 胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧 光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受 激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或 桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织， 从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利 用定量技术测定含量。
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五、优缺点及注意事项
优点：特异性高、敏感性高、速度快
缺点：非特异性染色
注意事项：
1、每次试验应设阳性和阴性对照
2、应注意荧光抗体的质量
含有氨基的荧光素标记
含有氨基的荧光素标记
荧光素标记是一种常见的生物分子标记技术，其中荧光素分子被连接到另一个分子上，以便在特定波长下发出荧光。
荧光素标记通常用于生物医学研究中的蛋白质组学、基因组学和细胞生物学等领域。
含有氨基的荧光素标记通常具有较高的水溶性和稳定性，适用于各种生物分子标记应用。
氨基是荧光素分子中的一个重要官能团，可以与其他化合物发生化学反应，从而实现荧光素分子与目标分子的连接。
其中，5-氨基荧光素（5-Aminofluorescein，也称为5-FAM）是一种常用的荧光素标记。
它具有活泼的胺基官能团，可以与其他化合物发生多种化学反应，如与蛋白质、抗体、核酸等进行共价连接，实现特异性荧光标记。
由于其具有高荧光量子产率和稳定性，5-氨基荧光素通常被用于核酸和蛋白质的标记研究。
另外，ATTO 647N NHS酯（ATTO 647琥珀酰亚胺酯，ATTO 647N活性酯）也是一种常用的含有氨基的荧光素标记。
它是一种基于罗丹明的荧光标记，用于红色光谱区，具有强吸收、高荧光量子产率、高热稳定性和光稳定性。
由于其具有较高的光稳定性和良好的吸收性能，ATTO 647N NHS酯通常被用于单抗和多抗的标记研究。
总之，含有氨基的荧光素标记在生物医学研究中具有广泛的应用价值。
通过这些标记技术，可以实现对生物分子的特异性荧光标记，从而更好地研究它们的性质、结构和功能等。
荧光剂的主要成分
荧光剂的主要成分荧光剂是一类能够在受到激发后发出荧光的化学物质，广泛用于生物医学、材料科学、环境监测等领域。
荧光剂的主要成分可以分为有机荧光剂和无机荧光剂两大类。
有机荧光剂是指由碳、氢、氧、氮等元素组成的有机物质，其主要特点是具有较高的发光效率和较长的发光寿命。
其中，最常见的有机荧光剂之一是荧光素。
荧光素是一种天然存在的有机化合物，具有强烈的荧光特性，可广泛应用于生物荧光成像、荧光标记和荧光探针等领域。
另一类有机荧光剂是吡啶类化合物，如吡啶、噻吩和咔唑等。
这些化合物具有较高的光稳定性和荧光量子产率，可以通过调节其结构和取代基来改变其发光性质，从而满足不同应用领域的需求。
无机荧光剂是指由金属离子或稀土离子组成的无机物质，其主要特点是具有较高的发光强度和较窄的发光峰宽。
其中，最常见的无机荧光剂之一是铜离子。
铜离子可以与有机配体形成络合物，在发光过程中发出强烈的荧光信号，因此被广泛应用于荧光传感和生物成像等领域。
稀土离子也是重要的无机荧光剂。
稀土离子具有丰富的能级结构和特殊的发光性质，可以发出不同颜色的荧光。
其中，钆离子、铽离子和镧离子等常用的稀土离子在生物荧光成像和荧光探针方面具有广泛的应用前景。
除了有机和无机荧光剂，还有一类特殊的荧光剂是量子点。
量子点是一种纳米级的半导体材料，具有独特的光学性质。
量子点的荧光颜色可以通过调节其粒径和组成元素来控制，因此被广泛应用于生物标记、光电器件和荧光探针等领域。
荧光剂是一类重要的化学物质，其主要成分包括有机荧光剂、无机荧光剂和量子点。
这些荧光剂在生物医学、材料科学和环境监测等领域发挥着重要作用，为科学研究和应用开发提供了有力支持。
随着技术的不断进步，相信荧光剂在未来会有更广泛的应用前景。
荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)教学提纲
荧光光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤色系统： 激发滤色片：置于光源与物镜之间，用于选择激发光范 围，只有能激发荧光染料发光的特定波长 的光通过。 阻挡滤色片：物镜和目镜之间，选择性通过特异的荧 光，呈现专一的荧光色彩。
光路
透射荧光显微镜光路(a)
（二）盖玻片
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用 干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起 不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利 通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。
（三）标本
组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在 标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重 迭或杂质掩盖，影响判断。
荧光分光光度计的基本结构是 : 光源 单色器或滤光片 样品池 单色器或滤光片 检测器荧光分光 Nhomakorabea度计原理图
注意事项：
（1） 注意开机顺序。 （2） 注意关机顺序。 （3） 为延长仪器使用寿命，扫描速度、负高
压、狭缝的设置一般不宜选在高档。 （4） 关机后必须半小时（等氙灯温度降下）
方可重新开机。
8 荧光技术的应用
（四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮
度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和 0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。
（五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜
油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石 蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。
荧光技术
韩东洺 细胞生物学科
常见荧光素
常见荧光素：（1）异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
（2）四乙基罗丹明(rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。
Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。
绿色荧光蛋白和荧光素发光原理
绿色荧光蛋白和荧光素发光原理1. 引言：荧光的魅力说到发光，大家脑海中是不是会闪现出五光十色的景象？比如夜空中的星星、深海中的生物，甚至是那些可爱的小虫子们。
今天，我们就来聊聊“绿色荧光蛋白”和“荧光素”的发光原理。
这俩家伙可不简单，它们在科学界可是赫赫有名！就像小朋友们喜欢的超级英雄一样，它们都有各自的“超能力”。
那么，这些荧光家伙到底是怎么让我们眼前一亮的呢？2. 绿色荧光蛋白（GFP）2.1 GFP的起源绿色荧光蛋白，简称GFP，最初是从一种海洋水母中发现的。
想象一下，这水母在海里游来游去，随时随地都能发出迷人的绿色光芒，简直就像海底的明星！后来，科学家们把这个神奇的蛋白提取出来，发现它在研究生物体时可以发挥大作用。
比如，它可以标记细胞，帮助研究人员观察细胞的活动，真是个无敌的小帮手。
2.2 GFP的发光原理那么，GFP是怎么发光的呢？这就要提到它的结构了。
GFP里有一种叫“色氨酸”的氨基酸，平时看起来毫不起眼，但它一遇到特定的光照，就开始“激动”起来。
经过一番“舞动”，它就会释放出能量，变成美丽的绿色光芒。
就好比一颗小星星在黑夜中闪烁，光彩夺目。
这种发光过程，我们称为“荧光”。
而且，GFP是相对稳定的，能在细胞中长时间发光，所以它被广泛应用于各种生物研究中。
3. 荧光素（Fluorescein）3.1 荧光素的介绍说到荧光素，大家可能觉得这个名字听起来有点陌生，但它可是在化学界里炙手可热的存在！荧光素是一种合成染料，颜色多样，最常见的当然是鲜艳的绿色。
它广泛应用于医学、环保监测，甚至是材料科学。
这玩意儿就像一位多才多艺的明星，能够在不同的场合展现自己的才华。
3.2 荧光素的发光原理荧光素的发光原理和GFP有点相似，但又各有千秋。
它的分子结构里有多个共轭双键，这些双键就像一条条“小桥”，让电子在分子间自由游走。
当荧光素被激发光照射时，这些电子就会快速跃迁，随后又很快回到原来的状态，同时释放出能量，形成荧光。
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常见荧光素：
（1）异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) ：FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
（2）四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。
最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
（3）四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。
Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。
FL2探测器检测PE。
（6）多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）：PerCP 是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为
35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。
FL3探测器检测PerCP。
（7）碘化丙啶（ propidium iodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。
在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA
对DNA荧光定量精度的影响。
在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。
FL2探测器检测PI。
常见荧光素的特性：
（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
（3）TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
（4）镧系：Eu、Tb
（5）PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。
（6）其它：酶作用后产生荧光物质。
酶作用后产生荧光物质：
酶底物产物激发光发射光
B-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
HRP HPA 二聚体317 414
酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。
例如，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。
其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕 (Eu3+)、铽 (Tb3+) 等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。