免疫组化组织细胞的取材、固定、切片操作方法及要点

从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。

取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。

用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。

取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。

组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。

一、动物的致死法及取材(一)致死法(1)空气栓塞法向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。

一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。

(2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。

适用于鼠等小动物。

(3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。

适用于小动物。

(4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。

(5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。

(二)取材注意事项易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。

(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。

因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。

二、尸体解剖的取材尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。

(1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。

(2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。

(3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。

(3)脾一块。

(4)胰一块。

(6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。

右肾一块切成正方形，左肾一块切成长(7)膀胱一块。

(8)肾上腺左、右各取一块。

(9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。

(10)骨脊椎骨一块。

(11)胸腺一块。

(12)子宫宫颈和宫体数块。

(13)睾丸或卵巢各一块。

(14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。

(15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。

如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。

三、活检标本的取材(一)常规活检标本的取材应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。

取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。

取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。

(二)肾穿刺标本的取材进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织(肾组织应为暗红色)。

当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。

在解剖显微镜下，肾皮质较淡，皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点，此即为肾小球。

使用解剖显微镜可帮助区别组织，作出准确的判断，使肾活检可靠。

穿刺所取得的标本用手术刀片切开，并迅速固定，一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶内，另一半放人装有电镜固定液的小瓶内，均置于冰瓶内保存。

小标本常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。

它们体积较小，面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。

因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。

免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。

将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。

而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。

不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。

固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。

一、固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。

固定液分为简单固定液和混合固定液。

因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。

西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。

二、固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。

2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。

主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。

具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。

3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。

将固定液注入血管，以达到充分的固定。

经血管分支到达整个组织或全身(1)局部灌注固定固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。

固定眼球组织可从眼后房注人固定液。

固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。

脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。

(2)全身灌注固定较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。

固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500～1000ml，猴、狗约1000—2000ml。

4．微波固定法近几年来微波固定法一直可见报道。

经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。

免疫组化组织细胞的脱水(一)概述组织经固定和水洗后，会有大量的水分留在组织中，而水又不能与苯融合，因此必须在透明前脱去组织中的水分。

用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程称为脱水。

对于不同的组织应分开脱水，特别是一些易脆的组织(如肝、脾等)应严格掌握脱水时间，防止在无水酒精中停留时间过长。

对于动物组织，应比人体标本相应缩短脱水时间。

脱水应按照从低浓度到高浓度的过程，否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形，从而影响切片，还会造成免疫组化实验过程中的脱片。

(1)乙醇最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化，与二甲苯能混合。

其缺点是在高浓度乙醇，特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。

尤其是应用全自动脱水机，因是加压抽真空并加温脱水，在高浓度乙醇中停留时间更不能太长，应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间，不能盲目从书本上套用脱水时间。

脱水时，应从低浓度向高浓度梯度进行。

一般是人体组织从?5％乙醇开始，对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30％乙醇开始脱水。

只有脱水充分，才能在透明剂中透明。

若是人工脱水，必须在加盖的容器内进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天更应注意。

在透明前最好将组织取出，用滤纸吸干后再透明。

(2)丙酮脱水作用比乙醇强，但对组织的收缩也大，毒性强，价格高，因此一般不用于常规组织的脱水，主要用于快速脱水及固定兼脱水。

此时应注意个人防护，最好在带有抽风功能的装置中进行，脱水时间1～3h左右。

丙酮还可作为染色后的脱水剂，用于甲基绿—派洛宁显示DNA及RNA。

(3)正丁醇为五色液体，微溶于水，在100ml水中只能溶解8．3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。

它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。

一般用法为：组织经固定及冲洗后，依次人50％、70％、80％乙醇中脱水，然后人正丁醇，12～24h后浸蜡。

使用时也应注意防护。

(4)叔丁醇异丁醇的一种，可与水、乙醇、二甲苯混合，可以单用或与乙醇混合使用，是一种使用较广的脱水剂，它不会使组织收缩或变硬，不必经过透明而直接浸蜡。

电镜上为常用的中间脱水剂。

(5)环己酮沸点为140~C，冰点为一40~C，密度与水相似，无毒，可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合，也是石蜡溶剂，可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡，组织不会变硬，不需经二甲苯透明。

(6)松脂醇组织固定后按常规经各浓度乙醇至95％乙醇中，按下列顺序进行脱水和透明处理：①浸入等份95％乙醇和松脂醇的混合液中，待组织块下沉后转入下步处理；②95％乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h；③95％乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h；④松脂醇I、Ⅱ、Ⅲ中各浸泡1h；⑤松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh，然后浸蜡包埋。

多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。

经松脂醇处理的组织收缩较小，发生硬化也少。

中性缓冲福尔马林影响HE染色用中性缓冲福尔马林后，细胞核颜色的确不够鲜艳，可在染苏木素前用3%冰醋酸媒染10分钟，会有所改善。

免疫组化组织细胞的固定（续）三、固定的注意事项1．固定液的量固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。

固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。

2.固定的组织必须新鲜组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。

3.组织块的体积组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1．OcmXl．OcmX0．2cm。

组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。

4．组织固定后的冲洗组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。

特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。

对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。

四、影响固定的因素1．温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70～37℃之间，?以室温22℃常用。

某些酶的固定要求在37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用丙酮在-20一-40℃之间固定30min最佳。

对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用中性甲醛在40℃左右固定2～3h即可。

2．浓度10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为95延。

在37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。