细胞毒性实验步骤-3
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解
如有侵权请联系网站删除细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1、倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2〜10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS勺培养液1〜1.5ml［培养液：胰酶=（2〜3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10〜15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS ffl胞培养液1〜2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁；10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
细胞增殖-毒性实验步骤
细胞增殖-毒性实验步骤1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。
显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；CCK-8实验：9）在96孔板中，给每孔加100μL（约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；10）向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
细胞毒性实验方案【可编辑范本】
细胞毒性实验设计方案1.准备材料: DＭＥM（高糖)胰酶双抗（青霉素/链霉素)DAPI MTT（5mｇ/ｍＬ) DＭSＯ PBS 4％多聚甲醛指甲油6孔培养板 9６孔培养板超薄载玻片培养瓶(25ｍL）一包0。
４5μｍ滤膜灭菌: 50mＬ,1０mL,5mL离心管两种枪头2．实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅(SiＯ2－ＳＳ－HＡ/DOX)，在高谷胱甘肽条件下,二硫键断裂，透明质酸脱离,同时夹心二氧化硅中药物得以释放.本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2—SS-HA／DOX）的细胞毒性。
实验组为SｉO2-ＳS—HA/DＯX、SｉO２—SS－HA、DOX，空白对照组为纯细胞，分别采用HeｐＧ2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L９2９成纤维细胞为正常细胞模型。
采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiＯ２—SS-ＨA/ＤOX、SｉＯ2—ＳS—HA、DOX,空白对照组为纯细胞。
培养基中含有1０% （v／v) FBＳ和１% (w/ｖ) 双抗(青霉素/链霉素)。
配制不同浓度的ＳiO2—ＳＳ—HA/DOＸ、ＳiＯ2、HA、DOX药物载体培养基溶液。
（１）。
以HｅpＧ2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型:培养基的配置:双抗 1％血清１2% ＤMEＭ87%具体操作步骤:细胞的复活:①将冻存于液氮中的细胞取出,迅速放入37℃温水中,使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加5ｍL无血清培养基,1000rmp,5ｍｉn离心去上清，再加5mL有血清培养基,转移至培养瓶中。
（每次转移时,将之前的离心管洗涤,并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
)③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代:将0．25%的胰酶分装至小离心管中,每个管中2mＬ,冻存于-２0℃,每次使用一管,避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧,喷7５%的酒精放入超净台．②将培养液倒入废液缸,残留培养基用吸管吸干净，操作完成后,培养瓶口用火烧。
细胞毒实验
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
MTT法测细胞毒性
MTT法测细胞毒性试剂MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。
含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g浓HCl（36%）86.2 ul定容至100ml，过滤除菌方法1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔板，100ul/孔，即细胞数104/孔。
空白孔不加细胞悬液。
,37℃条件下培养24小时。
2.5%CO23.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。
阴性对照孔不加毒素。
,37℃条件下培养72小时。
4.5%CO25.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml，37℃条件下培养4小时。
6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30分钟。
7.酶标仪上测定A570。
8.计算细胞死亡率：细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100%注意1．细胞数范围：（0.5~2）×104。
2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。
3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。
4．设置空白与对照空白孔：——+——+MTT+有机溶剂对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。
用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
毒理学实验设计模板
毒理学实验设计模板一、概述毒理学是研究化学物质对生物体产生的毒性效应的科学。
毒性实验是毒理学研究的重要手段之一，通过设计合理的实验，可以评估化学物质的潜在毒性，为毒性评估和风险评估提供科学依据。
本文将介绍一个毒理学实验设计模板，以帮助研究人员设计可靠、准确的毒性实验。
二、实验目的明确实验的目标，可以有多个目的，例如：1.评估化学物质对特定细胞系的细胞毒性；2.确定化学物质对实验动物的急性毒性；3.研究化学物质在生物体内的代谢过程。
三、实验设计1. 实验类型根据实验目的，确定实验类型，可以有以下几种类型：1.细胞毒性实验：使用细胞培养技术，评估化学物质对细胞的毒性效应；2.急性毒性实验：在实验动物中测定化学物质的急性毒性；3.代谢动力学实验：观察化学物质在生物体内的代谢过程。
2. 样本选择根据实验类型，选择适当的样本，可以有以下几种样本：1.细胞系：选择与研究对象相关的细胞系，例如癌细胞系、正常细胞系等；2.实验动物：根据研究目的选择合适的实验动物，例如小鼠、大鼠、猴子等。
3. 化学物质选择根据实验目的和样本选择，确定实验所需的化学物质，包括测试化合物和阳性对照物质。
4. 实验组设计根据实验目的，将实验样本分为实验组和对照组，其中实验组接受待测化学物质处理，对照组接受无处理或阳性对照物质处理。
5. 实验参数测定根据实验目的和实验类型，确定需要测定的实验参数，可以有以下几种参数：1.细胞毒性实验：测定细胞存活率、细胞增殖率等；2.急性毒性实验：测定动物的中毒症状、存活率等；3.代谢动力学实验：测定化学物质在生物体内的浓度、代谢产物等。
6. 数据处理和统计分析对实验数据进行统计分析，计算实验参数的平均值、标准差等。
根据实验目的，选择合适的统计方法，如t检验、方差分析等。
四、实验步骤1. 实验准备准备所需的实验设备、试剂和动物。
确保实验环境的安全和洁净。
2. 细胞毒性实验步骤1.培养细胞：将细胞悬浮液加入培养皿中，培养到适当的细胞密度。
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细胞毒性实验步骤
一、样品准备
准备规则尺寸样品，平行样≥3个。
所有样品采用75%酒精杀菌消毒how？，烘干后紫外照射how long？，灭菌处理。
二、浸提液制备
样品灭菌后按照1.25cm2/mL（1cm2/mL、3cm2/mL）比例加入含10%小牛血清和100U/ml 双抗（青霉素和链霉素）的DMEM，置于37℃，5%CO2培养箱内培养24h（72h）得到浸提液，0.22μm微孔滤膜除菌后备用。
三、实验分组
样品浸提液为实验组，阳性对照组为10%的DMSO（二甲基亚砜），阴性（空白）对照组为含10%小牛血清和100U/mL双抗的DMEM。
实验组共3（6）个点，分别为24h（72h）浸提液各培养1、3、5天。
四、L929细胞浓度选择及细胞计数
选择生长状态良好的细胞用PBS冲洗三次，2.5g/L胰蛋白酶消化后离心，制备不同浓度的细胞悬液（1×103/mL、1×104/mL、2×104/ mL、3×104/ mL、1×105/ mL）。
细胞计数：将细胞悬液滴在细胞计数板上，盖上盖玻片（从一头压到另一头，防止气泡产生），在显微镜下计数，数计数板上四个角上四个区域所含细胞总数X，细胞浓度为X/4×104 /ml。
五、细胞形态观察和细胞毒性测定
将配好浓度的细胞悬液加入3块96孔板，3块培养板分别编号1天、3天、5天，每孔100μL（根据实验组计算好加入量，每种金属浸提液对应8-16孔细胞悬液），37℃ , 5 % CO2条件下培养24h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS冲洗3遍后分别加入实验组24h、（72h）浸提液、阳性对照组10%的DMSO、阴性对照组含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM,，每孔100μL继续培养。
1、3、5天各取一块培养板在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。
每孔加入10μL MTT后继续培养4h，小心抽出每孔内浸提液，每孔加入150 μL DMSO. 水平振荡器（脱色摇床）振荡培养板10min，570nm波长下用自动酶标检测仪上测定各孔OD值。