细胞培养及材料细胞毒性检测
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
CCK_8操作说明及检测步骤
CCK_8操作说明及检测步骤CCK-8是一种常用的细胞增殖和细胞毒性检测方法，可以评估药物、毒物和其他试剂对细胞增殖的影响。
本篇文章将介绍CCK-8实验的操作说明及检测步骤。
实验材料：1.细胞培养物：包括细胞培养基和要检测的细胞系。
K-8试剂盒：包括CCK-8试剂和添加剂（如无血清培养基）。
实验步骤：1.细胞预处理：a.将细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
b.用PBS洗涤细胞，以去除培养基中的血清和其他杂质。
c.加入细胞培养基（如无血清培养基）孵育一天以适应新的生长条件。
K-8溶液的制备：a.从CCK-8试剂盒中取出所需量的CCK-8试剂。
b.按照试剂盒说明书中的方法，将CCK-8试剂溶解于适当的溶剂中，以获得CCK-8溶液。
3.细胞处理：a.在细胞培养皿中加入适量的处理组（含药物/毒物/试剂）和阴性对照组（不含处理）。
b.孵育细胞以使其与处理组接触，一般孵育24小时。
c.如果需要在不同时间点进行测量，可以设置不同的处理时间。
4.检测步骤：a.将培养皿从孵育器中取出，加入CCK-8溶液。
一般将CCK-8溶液与培养基混合，使浓度为10%。
b.返回孵育器中继续孵育15至60分钟，以使CCK-8溶液充分与细胞相互作用。
c. 使用酶标仪测量细胞的吸光度。
一般使用450nm波长进行检测。
d.记录各处理组的吸光度值。
5.数据分析：a.根据实验要求，选择合适的数据分析方法。
常用的包括比较各示踪实验组与阴性对照组之间的吸光度差异，或者使用半数抑制浓度（IC50）来评估样品对细胞增殖的影响。
b.绘制呈现实验结果的图表和图形。
c.进行统计分析，如t检验或方差分析，并计算显著性水平。
注意事项：1.操作前应严格按照实验室安全规定进行，佩戴实验室所需的个人防护设备。
2.在各步骤中，应尽量避免细胞暴露在环境中的时间过长，以减少细胞的应激反应。
3.操作时要注意使用无菌环境和无菌操作，以防止细胞污染。
4.实验中的所有操作必须根据实验室方法进行，避免任何操作的偏差。
动物细胞培养和细胞毒性测试的研究
动物细胞培养和细胞毒性测试的研究随着生物技术和医学研究的不断发展，动物细胞培养和细胞毒性测试成为了重要的工具。
动物细胞培养是指将动物细胞从体内分离出来，使其在人工培养条件下维持其生长和分化的一种技术。
细胞毒性测试则是通过对细胞对某种物质的反应，来评估该物质对细胞的危害程度。
在生物医药领域，这两项技术可以用于药物筛选、新药研发、毒性评价等方面。
动物细胞培养的建立动物细胞培养的建立可以追溯到20世纪初。
当时，人们对细胞结构和功能有了初步认识，开始探索不同动物细胞在培养基中的生长情况。
在20世纪50年代，随着细胞培养技术的进一步发展，人们可以培养出越来越多种类的细胞。
培养出的细胞可以在体外维持其特有的生理功能和代谢过程，从而成为了进行细胞毒性测试、植物和动物细胞的研究的重要试验材料。
目前，动物细胞培养技术的发展已经非常成熟。
人们能够在实验室内通过不同的培养条件，培养出多种细胞，包括人类癌细胞、小鼠胚胎细胞、大鼠成纤维细胞等。
这些细胞在培养基中的生长和分化过程与体内相似，能够模拟人体生物学过程，从而成为了生物学、药学和医药领域的重要工具。
细胞毒性测试的意义和流程细胞毒性测试的意义在于评估物质对细胞的毒性程度以及其对人体健康的危害性，一般可以分为以下步骤：第一步是筛选化合物，即考察化合物的生物活性。
这一步通常采用高通量筛选技术，可以同时测试多个化合物的生物活性。
第二步是确定化合物的毒性程度。
在该步骤中，通常使用细胞文化技术，比如细胞增殖检测法和细胞毒性测定法。
这些技术可以测量化合物对细胞的影响，包括它的毒性以及对细胞的增殖、分化和细胞形态的影响。
第三步是确定化合物的毒性机制。
在该步骤中，需要对受影响的细胞进行深入研究，以了解化合物产生毒性的原因。
这些研究可以探讨影响细胞增殖的通路、凋亡机制和细胞信号传导途径等。
细胞毒性测试在医学和药学领域中有重要的应用。
在药物研发的早期阶段，通常会对药物进行细胞毒性测试，以确定药物是否对人体安全。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
生物医用材料生物学评价标准和试验方法
生物医用材料生物学评价标准和试验方法生物医用材料是指可以应用于人体内的材料，例如人工关节、生物支架、医用植入材料等。
这些材料需要经过严格的生物学评价来确保其安全性和有效性。
生物学评价标准和试验方法是评估生物医用材料的重要工具，可以帮助制药企业和研究机构准确地评估材料的生物相容性、毒性和应答性。
一、生物学评价标准1. 细胞培养试验细胞培养试验是评估生物医用材料对细胞生长、增殖和凋亡的影响。
通过观察细胞在材料表面的粘附、形态和代谢活性等指标，可以初步判断材料的生物相容性和毒性反应。
2. 动物试验动物试验是评估生物医用材料在体内的生物学行为和反应。
常用的动物模型包括小鼠、大鼠、兔子和猪等。
通过植入材料后观察动物的炎症反应、组织修复和免疫应答，可以全面评估材料在体内的安全性和有效性。
3. 体外毒性试验体外毒性试验是评估生物医用材料对细胞和组织毒性的影响。
常用的试验包括溶菌圈试验、细胞毒性试验和血凝试验等。
通过这些试验可以及早发现材料的潜在毒性风险，确保其在临床应用中不会对患者造成不良影响。
二、试验方法1. 材料表面形貌观察通过扫描电镜和透射电镜等技术，观察生物医用材料表面的形貌和结构特征，可以初步判断材料的表面粗糙度、结晶度和微观结构，为后续的生物学评价提供基础数据。
2. 细胞培养试验通过将生物医用材料表面接触细胞培养，观察细胞的粘附、增殖和凋亡情况，可以评估材料对细胞生物学行为的影响，进而判断其生物相容性和毒性反应。
3. 动物植入试验将生物医用材料植入动物体内，观察材料对组织的影响和动物的生物学应答，可以全面评估材料在体内的生物相容性、组织修复和免疫应答等指标。
4. 体外毒性试验通过体外毒性试验，包括溶菌圈试验、细胞毒性试验和血凝试验等，可以快速评估生物医用材料的潜在毒性风险，为临床应用提供安全保障。
三、个人观点和理解生物医用材料的生物学评价标准和试验方法是确保材料安全性和有效性的重要环节。
通过细胞培养试验、动物试验和体外毒性试验等多种评价手段，可以全面评估材料的生物相容性、毒性和应答性。
抗癌药物细胞实验报告
一、实验背景癌症作为一种严重威胁人类健康的疾病，其治疗一直是医学界的研究重点。
近年来，随着分子生物学、细胞生物学等领域的不断发展，越来越多的新型抗癌药物被研发出来。
为了评估这些新型抗癌药物的疗效和安全性，细胞实验成为了一种重要的研究手段。
本实验旨在通过细胞实验研究某新型抗癌药物的活性及其对肿瘤细胞的影响。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：人肺癌细胞A549、人正常肺上皮细胞HepG2（2）抗癌药物：某新型抗癌药物（以下简称药物A）（3）试剂：细胞培养试剂、细胞毒性检测试剂盒、流式细胞仪等2. 实验方法（1）细胞培养：将人肺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞HepG2分别接种于96孔板中，置于细胞培养箱中培养。
（2）药物处理：将A549细胞分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。
对照组加入等体积的溶剂，低、中、高剂量组分别加入不同浓度的药物A。
（3）细胞毒性检测：在药物处理24小时后，采用细胞毒性检测试剂盒检测细胞活力。
（4）细胞凋亡检测：采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（5）数据统计分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，比较各组间的差异。
三、实验结果1. 细胞毒性检测结果显示，随着药物A浓度的增加，A549细胞的细胞活力逐渐降低，而HepG2细胞的细胞活力基本保持不变。
这说明药物A对A549细胞具有显著的细胞毒性，而对正常细胞影响较小。
2. 细胞凋亡检测结果显示，随着药物A浓度的增加，A549细胞的凋亡率逐渐升高，而HepG2细胞的凋亡率基本保持不变。
这说明药物A对A549细胞具有显著的诱导凋亡作用。
四、实验讨论1. 药物A对A549细胞的细胞毒性作用实验结果显示，药物A对A549细胞具有显著的细胞毒性作用，这可能与其抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用有关。
此外，药物A对正常细胞影响较小，表明其具有较好的安全性。
2. 药物A对A549细胞的诱导凋亡作用实验结果显示，药物A对A549细胞具有显著的诱导凋亡作用，这可能是其治疗肿瘤的重要机制之一。
WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
图2. WST-1、XTT 和MTT 的检测效果比较 注：450nm 为测定波长，690nm 为参考波长WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 产品编号 产品名称 包装C0035 WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 100次产品简介：WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-1是一种类似于MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan (参考图1)。
细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
图1. WST-1检测原理图 (EC=electron coupling reagent ，即电子耦合试剂) WST-1是MTT 的一种升级替代产品，和MTT 或其它MTT 类似产品如XTT 、MTS 等相比有明显的优点。
首先，MTT 被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT 、MTS 产生的formazan 都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。
其次，WST-1产生的formazan 比XTT 和MTS 产生的formazan 更易溶解。
再次，WST-1比XTT 和MTS 更加稳定，使实验结果更加稳定。
另外，WST-1和MTT 、XTT 等相比，线性范围更宽，灵敏度更高(参考图2)。
本试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等。
本试剂盒检测非常便捷。
无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。
不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外步骤去溶解formazan 。
可以用于大批量样品的检测。
酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。
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➢ 原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养
➢ 传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养
➢ 传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞
细胞培养的工作原则
➢ 无菌
➢ 无毒、生物相容性
➢ 清洁的环境
➢ 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和 去离子水
➢ 有标准化的工作方法
灭菌器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，
移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱
常用仪器与设备
➢ 超净工作台 ➢ 高压蒸汽灭菌器 ➢ 过滤除菌装置 ➢ 倒置显微镜 ➢ 水纯化装置 ➢ 恒温培养箱 ➢ 电热干燥箱 ➢ 离心机、天平、水浴、摇床 ➢ 液氮罐 ➢ 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃
细胞培养
cell culture
主要内容
➢ 前言 ➢ 细胞培养的基本概念 ➢ 细胞培养的基本条件 ➢ 细胞培养的基本方法 ➢ 细胞培养的污染和检测 ➢ 细胞冻存和复苏 ➢ 细胞管理及保藏 ➢ 细胞毒性检测
1.前言
1885年Roux最早尝试使组织离体培养， 材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养
液，并首次采用组织培养这个术语。
培养室 工作台
＋
玻璃 制品
＋
＋
金属 器械
＋
＋
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
＋
布类 棉类
＋
＋
化学 气体
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
4.细胞培养的基本方法
贴附生长型细胞 必须贴附于底
物才能生长的细 胞。从形态上大 体分为上皮细胞 型及成纤维细胞 型，还有一些难 以确定其稳定形 态的细胞。
Wilhelm Roux (1850-1924 )
1907年Harrison 和1912年Carrel开始把 组织培养作为一种方法，用于研究离体动物
细胞的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了34年
之久(1912-1946)
Alexis Carrel France
Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
成纤维细胞样细胞
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动
培养细胞的生长和增殖过程
血清的使用
➢ 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等
➢ 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。
➢ 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。
➢ 血清的消毒：过滤除菌
其他细胞培养用液
水：新鲜的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液
主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度
细胞培养器材
➢ 移液器 ➢ 移液管 ➢ 吸管 ➢ 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 ➢ 培养皿： 30、60、120毫米 ➢ 多孔培养板： 4、6、24、96孔 ➢ 离心管 ➢ 冻存管
× ×
完全培养基的组成
➢ 基础培养基 ➢ 血清 ➢ 青、链霉素
80％～95％ 5％～20％
各100U／ml
常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液
（D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 配制
具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭
菌双蒸水，即每毫升各为20万U。
使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。 庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。
天然培养基：
培养基
血清
血浆
组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）
合成培养基：
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模 拟合成的。
包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合 物
目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
粘着、粘附 （attachment）
铺展 （spreading)
肿瘤
胚胎
成体
粗切
消化
细切
修切
细胞培养 组织培养 器官培养
细胞培养的优点
➢ 活细胞 ➢ 便于观察检测 ➢ 条件可胞与体内细胞的差异
➢ 失去原有组织结构和形态，趋向单一性 ➢ 分化减弱 ➢ 可能获得不死性
体外培养细胞的生长类型
➢ 贴壁型：动物的正常细胞 ➢ 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 ➢ 固定化培养
➢ 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确， 所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等
➢ 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放
3.细胞培养的基本条件
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流 罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压
胰蛋白酶溶液
➢ 主要作用：
水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋 白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。
➢ 常用浓度：0.25%
用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤 器过滤除菌。
➢ 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。
物品 湿热 干热 过滤 紫外
2.基本概念
器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。
组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米） 置于底物上孵育，细胞自 其周围移出并生长。
细胞培养(cell culture)： 把提取的组织用机械或消 化的方法分散成单个细胞 悬液，后进行培养，增殖。