细胞毒性试验总结
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
细胞毒性实验总结
细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)二、细胞毒性实验方案的确立 (3)三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)五、细胞毒性实验SOP (6)（一）目的 (6)（二）适用范围 (6)（三）责任人 (6)（四）规程 (6)1. 试验准备 (7)2. 试验操作 (8)3．数据处理和分析 (8)六、总结 (9)一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。
按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。
类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。
毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。
1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。
有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。
化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。
目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。
3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
药物免疫毒性试验实验报告
药物免疫毒性试验实验报告实验目的：本实验旨在评估某药物对免疫系统的潜在毒性，通过一系列体外和体内实验，确定药物对免疫细胞功能的影响，为药物安全性评估提供科学依据。
实验材料：1. 药物样品2. 小鼠脾细胞3. 人外周血单核细胞(PBMCs)4. 细胞培养基5. 细胞计数板6. 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒7. 流式细胞仪8. 实验动物：BALB/c小鼠9. 其他必要的实验试剂和设备实验方法：1. 细胞培养：将小鼠脾细胞和人外周血单核细胞(PBMCs)在适宜的细胞培养基中培养。
2. 药物处理：将药物以不同浓度加入细胞培养体系中，进行不同时间的处理。
3. 细胞活性测定：采用MTT法测定药物处理后细胞的活性。
4. 细胞增殖能力测定：通过细胞计数板计数细胞数量，评估细胞增殖情况。
5. 细胞因子释放测定：使用ELISA试剂盒测定药物处理后细胞释放的细胞因子水平。
6. 细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡情况。
7. 免疫细胞功能测定：通过流式细胞仪检测药物处理后免疫细胞表面标志物的表达情况。
8. 动物实验：将药物以不同剂量给药于BALB/c小鼠，观察药物对小鼠免疫器官的影响，并进行免疫细胞功能的相关检测。
实验结果：1. 细胞活性：药物处理后，细胞活性随药物浓度的增加而降低，表明药物具有一定的细胞毒性。
2. 细胞增殖：药物处理组的细胞增殖能力较对照组有所下降，说明药物可能影响细胞的增殖。
3. 细胞因子释放：药物处理后，部分细胞因子的释放水平发生显著变化，提示药物可能影响免疫细胞的功能。
4. 细胞凋亡：药物处理组的细胞凋亡率较对照组有所增加，说明药物可能诱导免疫细胞凋亡。
5. 免疫细胞功能：药物处理后，免疫细胞表面标志物的表达发生变化，表明药物可能影响免疫细胞的活化和功能。
6. 动物实验：药物给药后，小鼠免疫器官的重量和形态发生改变，免疫细胞功能检测结果显示药物对小鼠免疫系统有影响。
毒性试验
遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。
一般而言，根据其检测的遗传学终点可分为4种类型：检测基因突变；检测染色体畸变；检测染色体组畸变；检测DNA原始损伤。
长期毒性试验
长期细胞毒性试验一般是在急性毒性试验结果的基础上，观察评价动物反复给予受试物后，机体产生毒性反应的特征及其毒性损害的严重程度，以及主要毒性靶器官及其损害的可逆性。
急性毒性试验
急性毒性试验是指在24小时内动物接受药物1-2次（间歇时间为6-8小时），观察给药后动物7-14天内所产生的急性中毒反应。
急性毒性试验可确定被研究药物的毒性程度，即剂量和不良反应之间的关系，亦可以比较被研究对象与其他已知急性毒性物的相对毒性程度，通过对不同给药途径出现毒性作用的比较研究， 就可以确定药物不同接触途径的相对危害。
受试物长期毒性试验的目的是提供受试物的无毒性反应剂量和临床主要检测指标，为制定人用安全剂量提供参考资料。
因此长期毒性试验的设计 最好能包括神经病理学、生理学、生物化学及相关的形态学指标的监测，还应注意受试物再组织中可能的蓄积，以及通过其他机制产生的延缓毒性作用等。
北校区北门2205师母,13515209736
致畸敏感期毒性试验大鼠致畸敏感期毒性试验：按受试品剂量分组，对雌性大鼠受孕后的第6-15天连续给药。观察受试品对胎仔外观、体重、身长、尾长、内脏和骨骼等的影响，并与生理盐水对照组比较。
围产期毒性试验大鼠围产期毒性试验：按受试品剂量分组皮下注射给药，给药时间为孕鼠妊娠15天开始至分娩后28天，观察受试品大、中、小三个剂量组，对大鼠胚胎后期生长发育、母鼠分娩、以及新生F1代大鼠的生理发育指标、神经反射发育指标和生殖功能，并与生理盐水对照组比较。
细胞培养实验员工作总结
细胞培养实验员工作总结
作为一名细胞培养实验员，我深知这项工作的重要性和挑战。
在过去的一段时
间里，我不断学习和成长，积累了丰富的经验。
在这篇文章中，我将总结我在这个岗位上的工作经历，并分享一些心得体会。
首先，作为细胞培养实验员，我需要具备扎实的细胞生物学知识和技能。
在日
常工作中，我负责细胞培养、细胞传代、细胞实验等工作。
我要保证细胞的健康状态，确保其纯度和活性。
同时，我还需要进行细胞实验，比如细胞毒性测试、细胞增殖实验等。
这些工作需要我对细胞培养技术有着深入的理解和熟练的操作技巧。
其次，我在工作中还需要具备严谨的实验态度和良好的团队合作精神。
在实验
室中，我们经常需要进行复杂的实验操作，需要严格遵守操作规程，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，我还需要和同事们进行密切的合作，共同完成实验任务。
团队合作精神和良好的沟通能力对于我们的工作至关重要。
最后，我认为作为细胞培养实验员，持续学习和不断提升自己的能力是非常重
要的。
细胞培养技术是一个不断发展和更新的领域，我们需要不断学习新知识，跟上最新的技术进展。
我会经常参加相关的学术会议和培训课程，不断提升自己的专业水平。
总的来说，作为一名细胞培养实验员，我深知这项工作的重要性和挑战。
通过
不懈的努力和持续的学习，我相信我可以不断提升自己的能力，为细胞培养实验工作做出更大的贡献。
希望我的经验总结能够对其他同行有所帮助，也希望在未来的工作中能够继续发挥自己的专业优势，为科学研究做出更多的贡献。
USP 87 细胞毒性 体外试验
87BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITROThe following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalian cell cultures following contact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or indirect patient contact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specimen cannot be determined, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to prevent contamination with microorganisms and other foreign matter.Three tests are described (i.e., the Agar Diffusion Test, the Direct Contact Test, and the Elution Test).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its intended use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; contacting media; inks; adhesives; absorption, adsorption, and permeability of preservatives; and conditions of storage. Evaluation of such factors should be made by appropriate additional specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its intended use. Materials that fail the in vitro tests are candidates for the in vivotests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.USP R EFERENCE S TANDARDS 11— USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS.Cell Culture Preparation— Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells inserum-supplemented minimum essential medium having a seeding density of about 105 cells per mL. Incubate the cultures at 37 ± 1in a humidified incubator for NLT 24 h in a 5 ± 1% carbon dioxide atmosphere until a monolayer, with greater than 80% confluence, is obtained. Examine the prepared cultures under a microscope to ensure uniform, near-confluent monolayers. [NOTE—The reproducibility of the In Vitro Biological Reactivity Tests depends upon obtaining uniform cell culture density. ]Extraction Solvents—Sodium Chloride Injection (see monograph—use Sodium Chloride Injection containing 0.9% of NaCl). Alternatively, serum-free mammalian cell culture media or serum-supplemented mammalian cell culture media may be used. Serum supplementation is used when extraction is done at 37for 24 h.Apparatus—Autoclave— Employ an autoclave capable of maintaining a temperature of 121 ± 2, equipped with a thermometer, a pressure gauge, a vent cock, a rack adequate to accommodate the test containers above the water level, and a water cooling system that will allow for cooling of the test containers to about 20, but not below 20, immediately following the heating cycle.Oven— Use an oven, preferably a mechanical convection model, that will maintain operating temperatures in the range of 50–70within ± 2. Incubator— Use an incubator capable of maintaining a temperature of 37 ± 1 and a humidified atmosphere of 5 ± 1% carbon dioxide in air.Extraction Containers— Use only containers, such as ampuls or screw-cap culture test tubes, or their equivalent, of Type I glass. If used, culture test tubes, or their equivalent, are closed with a screw cap having a suitable elastomeric liner. The exposed surface of the elastomeric liner is completely protected withan inert solid disk 50–75 µm in thickness. A suitable disk can be fabricated from polytef.Preparation of Apparatus— Cleanse all glassware thoroughly with chromic acid cleansing mixture and, if necessary, with hot nitric acid followed by prolonged rinsing with Sterile Water for Injection. Sterilize and dry by a suitable process for containers and devices used for extraction, transfer, or administration of test material. If ethylene oxide is used as the sterilizing agent, allow NLT 48 h for complete degassing.Procedure—Preparation of Sample for Extracts— Prepare as directed in the Procedureunder Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.Preparation of Extracts— Prepare as directed for Preparation of Extracts inBiological Reactivity Tests, In Vivo 88using either Sodium Chloride Injection (0.9% NaCl) or serum-free mammalian cell culture media as Extraction Solvents. [NOTE—If extraction is done at 37for 24 h in an incubator, use cell culture media supplemented by serum. The extraction conditions should not in any instance cause physical changes, such as fusion or melting of the material pieces, other than a slight adherence. ]Agar Diffusion TestThis test is designed for elastomeric closures in a variety of shapes. The agar layer acts as a cushion to protect the cells from mechanical damage while allowing the diffusion of leachable chemicals from the polymeric specimens. Extracts of materials that are to be tested are applied to a piece of filter paper. Sample Preparation— Use extracts prepared as directed, or use portions of the test specimens having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area. Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation.Procedure— Using 7 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 60-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the monolayers, and replace it with serum-supplemented culture medium containing NMT 2% of agar. [NOTE—The quality of the agar must be adequate to support cell growth. The agar layer must be thin enough to permit diffusion of leached chemicals. ] Place the flat surfaces ofSample Preparation, Negative Control Preparation, and Positive Control Preparation or their extracts in an appropriate extracting medium, in duplicate cultures in contact with the solidified agar surface. Use no more than three specimens per prepared plate. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1, preferably in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control, under a microscope, using a suitable stain, if desired.Interpretation of Results— The biological reactivity (cellular degeneration and malformation) is described and rated on a scale of 0–4 (see Table 1). Measure the responses of the cell cultures to the Sample Preparation, the Negative Control Preparation, and the Positive Control Preparation. The cell culture test system is suitable if the observed responses to the Negative Control Preparation is grade 0 (no reactivity) and to the Positive Control Preparation is at least grade 3 (moderate). The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed. Table 1. Reactivity Grades for Agar Diffusion Test and Direct Contact TestGrade Reactivity Description of Reactivity Zone0 None No detectable zone around or under specimen1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen2 Mild Zone limited to area under specimen and less than 0.45 cm beyond specimen3 Moderate Zone extends 0.45 to 1.0 cm beyond specimen4 Severe Zone extends greater than 1.0 cm beyondGrade Reactivity Description of Reactivity ZonespecimenDirect Contact TestThis test is designed for materials in a variety of shapes. The procedure allows for simultaneous extraction and testing of leachable chemicals from the specimen with a serum-supplemented medium. The procedure is not appropriate for very low- or high-density materials that could cause mechanical damage to the cells.Sample Preparation— Use portions of the test specimen having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area.Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Procedure— Using 2 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 35-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the cultures, and replace it with 0.8 mL of fresh culture medium. Place a single Sample Preparation, a Negative Control Preparation, and a Positive Control Preparation in each of duplicate cultures. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control Preparation, under a microscope, using a suitable stain, if desired. Interpretation of Results— Proceed as directed for Interpretation of Results under Agar Diffusion Test. The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed.Elution TestThis test is designed for the evaluation of extracts of polymeric materials. The procedure allows for extraction of the specimens at physiological or。
细胞毒性试验mtt方法-中英文
用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的细胞（293T细胞、MDCK细胞、Vero 细胞、CEF细胞），用DMEM培养基或MEM培养基（10%胎牛血清，1%双抗）制成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96孔板，每孔加入200ul培养基。
将培养板放到CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养24h，在细胞板孔内分别加入polyMAG/DNA复合物（0.5ul/0.25ug, 0.25ul/0.25ug, 0.25ul/0.5ug），Lipofectamine 2000/DNA复合物（0.5ul+0.2ug），质粒DNA（0.5ug），每个处理设三个复孔。
继续培养24h后，每孔加入20ul的MTT(5mg/ml)，37℃培养4h，终止培养，吸去孔内上清液；每孔加入150ul DMSO，摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶标仪上测定490nm各孔光吸收值，以不加细胞只加培养液的空白对照孔调零（其他实验步骤一致），以未经处理的空白细胞作为对照（三个复孔）。
根据公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=[OD490(样品)/OD490（对照)]x100。
The toxicity of nanoparticles was evaluated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) test. PK15 cells were planked in a 96 well plate with a concentration of 104 cells/well and cultured in 37℃5%CO2for 24 h. Then PK15 cells were treated with nanoparticlesat different concentrations(1:1, 1:2, 1:4), PEI, superfectand lipofectamine especially.PK15 cells untreated were used as control. After incubationfor 6 h,the medium was removed. PK15 cells were cultured in 37℃5%CO2 for 24 h, and were cultured for another 4 h inMTT(0.5%)containing DMEM, then the medium was carefully removed. 150ul/well dimethyl sulfoxide was added and oscillated gentlyto make crystal dissolved. The absorbance at 490 nm was measuredusing a microplate reader. The cell viability was expressed asa percentage of OD490(sample)/OD490(control).。
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（一）实验前应明确的问题1。
选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在不同时间点的测定OD值,输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显).4。
培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6。
理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整.7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
(二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2。
5%CO2,37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3—5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况。
3.5％CO2,37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察.4。
每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0。
5％MTT），继续培养4h.若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养,小心吸去孔内培养液.6。
每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)悬浮细胞：1）收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1：20)；③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。
每板设对照（加100ul(储存液100 1640）。
2）置37℃，5%CO2孵育16—48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0。
5%MTT），继续培养4 h。
（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4)，直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4)离心（1000转x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔.(三）MTT的配制MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶.PBS配方：Nacl 8g,Kcl 0。
2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调ph 7。
4，定容1L。
（四）关于细胞的接种(铺板)细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了；培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种，因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信.如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。
且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。
故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔.细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。
悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103—104.（五）加入MTT个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。
如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10％的比例加入。
加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀,不过这个应该关系不大.如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的.因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。
如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可.首先说说我的一点经验:1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀.10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液..。
2。
吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀.如果是吸液量1ml多的吸管,总液量在5ml左右为益3. 吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4。
吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了.加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。
）5。
向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央,而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。
所以速度不能太快也不能太慢.我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。
(铺板技术是MTT 实验的关键,也是基础，一定要练好。
曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。
其它的声音：1。
首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。
尤其是对于肿瘤细胞。
10000/孔是太高了,这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大.2。
MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪.特别是新手，20%的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
3。
我做的是肿瘤细胞的MTT实验，这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的，结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系。
后来调整浓度，用过40000～80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000～70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组，由于细胞少,药物作用的梯度还是有，只是没有很好的线性关系。
还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物）来确定培养时间是48小时还是72小时. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。
加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。
虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟,CV会在8%左右。
另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。
所以要熟练些、快些上板。