实验五ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg
ELISA法HBsAg检测的注意要点
ELISA法HBsAg检测的注意要点室内质控（IQC）是由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和控制本室常规工作的重复性和精密度，提高本室常规工作中样本检验的一致性，保证每个患者样本验测结果的稳定性。
临床实验室常规HBsAg检验步骤很多，基本上可分为标本收集、实验室测定过程和结果报告及其解释等；规范化的、认真细致的测定过程可以杜绝过失误差，减少随机误差，及时发现系统误差，在室内质控中起着决定性作用。
现将我科HBsAg检测过程中的注意要点报道如下：1 材料与方法1.1主要试剂及设备上海科华生物技术有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（批号20081217），省临验中心分发的HBSAg室内质控品（正常浓度批号为090040，病理浓度批号为090041），上海安泰生产酶标仪（AT－858）和洗板机（AT－828）。
1.2方法采用单克隆抗－HBS包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗－HBS－HRP，当标本中存在HBSAg时该HBsAg与包被抗－HBS结合并与抗－HBS－HRP结合形成抗－HBS－HBsAg－抗－HBS－HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
2规范化操作及注意要点2.1从冷藏柜中取出的试剂、质控品及待测标本均需室温平衡30分钟。
2.2待测标本、阴阳性对照及质控品应沿反应孔壁加入，不可有气泡。
2.3酶结合物、显色剂、终止液使用前应摇匀，并弃去1￣2滴垂直滴入。
2.4孵育的时间和温度应严格按试剂盒说明书操作。
2.5注意洗涤液不要溢出，防止污染它孔。
2.6洗板机选择洗涤5次程序，洗板后注意拍干。
2.7酶标仪读数时使用双波长（450nm和630nm），先用空白孔校零。
2.8封片不可重复使用。
2.9结果判断须在反应终止后10分钟内完成。
二个不同浓度的质控品随正常工作日患者样本一道，按试剂盒说明书同时检测。
3结果判断样品OD值/阴性对照平均OD值≥2.1为阳性，否则为阴性。
用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析
用两种方法检测乙肝表面抗原结果分析目的了解用ELISA法检测乙肝表面抗原和用化学发光法检测表面抗原两者之间的结果情况。
方法采集320例就诊人员的血液标本，分别用化学发光法与ELISA法检测。
结果320份标本中，发光法检测出40份阳性，280份阴性。
ELISA 法检测出42份阳性，278份阴性。
经χ2检验两者无显著性差异（P>0.05）。
结论ELISA法成本比较低，耗时长，实验的影响因素比较多，易出现假阳性。
化学发光法成本高，所需时间短，干扰因素少，不易出现假阳性。
标签：乙肝表面抗原；ELISA；化学发光流行病学调查结果显示，我国的乙型病毒肝炎感染性约达10%，乙肝的实验检测对其防治具有非常重大的意义[1]。
乙型肝炎病毒乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。
随着科学越来越进步，检测的手段也越来越多。
自20世纪70年代至今，诸多高敏感性的检测方法被广泛应用于临床免疫学的检测中，当中应用最为广泛的就属酶联免疫法（enzyme linked Immunosor bent assay，ELISA）[2]。
近几年，化学发光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）正逐渐发展，是一种敏感性较强的临床免疫学检测方法，有效解决了低浓度乙型肝炎病毒乙肝表面抗原的检测难题[3]。
现用ELISA法，化学发光法，这两种方法检测的相关性进行探讨。
1 资料与方法1.1一般资料标本来自于我院2016年3月1日～3月5日体检人员，共320例，男198例，女122例，年龄18～72岁，平均年龄为（39.5±8.4）岁。
1.2标本采集用红头采血管，真空抽取静脉血3 ml，标本静置后离心提取血清。
1.3检测试剂与仪器一种采用雅培化学发光HBsAg定量检测试剂盒，标本离心后，按照雅培I2000化学发光仪的操作规程检测。
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。
2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。
3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。
在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。
该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。
血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。
在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。
而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。
本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。
1.标本溶血由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。
有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。
要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。
2.标本受到污染标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。
3.标本放置时间在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。
乙肝五项检测
乙肝五项检测（ELISA法）一、检测目的：乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
二、测定原理：分别采用双抗体（抗原）夹心法和竞争法。
HBsAg、HBsAb原理：采用单克隆抗-HBs(HbsAg)包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP(HBsAg-HRP),当标本中存在HBsAg（HBsAb）时，该HBsAg（HBsAb）与包被抗- HBsAg（HBsAb）结合并与抗- HBsAg-HRP （HbsAb-HRP）结合形成抗- HBsAg（HBsAb）-抗- HBsAg-HRP（HBsAb-HRP）复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAg原理：采用抗-HBe包被反应板，加入待测标本，同时加入抗—HBe-HRP，如待测样本中抗HBeAg时，就与包被抗-HBe、抗—HBe-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAb原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBe含量高，则抗—HBe-HRP 与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
HBcAb原理：采用基因工程重组HbcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBc含量高，则抗—HBc-HRP 与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
三、操作步骤：1、将试剂从冷藏室中取出，30分钟后平衡至室温方可开启使用。
2、用蒸馏水将PBST浓缩液20倍稀释，作为洗液。
3、将微孔条固定于支架上，按序编号。
4、按具体使用试剂盒说明书加样、孵育、洗板、显色。
9、用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白调零，然后读取各孔OD值。
四、结果判断：样品OD值／阴性对照平均OD ≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。
酶联免疫吸附试验法检测乙型肝炎病毒表面抗原的质量保证
酶联免疫吸附试验法检测乙型肝炎病毒表面抗原的质量保证酶联免疫吸附试验(ELISA)法是医学检验的免疫学检验方法之一，已经广泛应用到对病原微生物的免疫学检查试验中[1]。
本文对ELISA法检测乙型肝炎(下称乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)的质量保证进行分析，报道如下。
1 标本的质量保证1.1 严格执行标本的查对制度，接收标本应将标本上的标签与申请单逐一核对，验收签字。
对科室自采的标本，接到申请单后，按申请单上的姓名将受检者喊应，确定性别、年龄，然后编号抽血，避免标本采集错误。
1.2 对检测HBsAg同时又有其他检测项目的，要采集双管血。
对只有单管血的标本，应先检测HBsAg，后送其他室进行检测，以避免相互交叉污染，出现错误的结果。
1.3 标本应及时检验，一次性塑料管标本放置时间不宜过久。
本室有1例弱阳性HBsAg标本，放置72 h后，检测呈阴性。
这是否与塑料有吸附HBsAg作用有关，有待进一步研究证实。
1.4 HBsAg检测使用血清，所以标本一定要充分离心，彻底去除纤维蛋白。
否则加进反应孔的血浆凝固可阻止HBsAg的游动，不利于与吸附在反应杯上的乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)结合，从而产生错误的假阴性结果。
对于重度溶血标本应重新采血进行测定。
对严重脂血、黄疸及药物治疗等影响检测结果的标本，亦应叮嘱受检者适时重新检测。
2 检测中的质量保证2.1 加样标本应加入反应孔的底部，加酶试剂时严防溅出孔外污染其他反应孔，且加酶时角度要相同，使各孔的酶剂量保持一致。
2.2 反应温度反应温度应准确至37℃，试剂使用前先放置室温平衡，而且还应考虑反应板放置水浴达到37℃这一平衡段所需的时间。
2.3 反应时间反应时间要准确，时间过短，特异性结合不够，易产生假阴性；时间过长，非特异性结合物紧附于反应孔，难以洗脱，测定值偏高。
2.4 洗板洗板是ELISA法中最重要的环节之一，特别是手工洗板，加入的洗液量以刚满反应孔为限。
ELISA法检测血清中HBsAg的结果不确定度分析
ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＨＢｓＡｇ的结果不确定度分析目前ELISA法在临床检验中已被广泛应用,具有一定的代表性,而有关ELISA 法检测结果的不确定度评定的应用报道很少。
本文根据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》[1],通过对典型例子不确定度的分析和量化,建立了ELISA法检测HBsAg结果不确定度的评定程序,通过对检测结果不确定度的评估,对检测结果进行完整地表达,避免或降低了出现假阴性结果的风险。
1 材料与方法1.1 材料试剂为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法),上海科华生物技术有限公司产品。
设备为Thermo MK3型酶标读数仪。
依据GB15990—1995《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》[2]进行检测。
1.2 方法在板架上放好酶标板条,每孔加入50 μL待测血清或阴、阳性对照,设阴、阳性对照各2孔。
每孔加入酶结合物50 μL,置37℃孵育30 min。
洗板5次后,每孔加显色剂A液、B液各50μL,置37℃孵育15 min。
每孔加入终止液50 μL后,用酶标仪读数,取主波长450 nm,参考波长630 nm读取各孔OD值。
2 结果2.1 被测物数学模型公式:ΔA=S-CO式中:ΔA—结论判定;S—待测血清吸光度值(OD值);CO—临界值(cut-off)=NCx×2.1。
NC—阴性对照OD值;NCx—阴性对照平均OD值;2.1为修正系数。
2.2 结果判定当阴性对照OD均值0.05时以实际OD值计算。
ΔA≥0者为HBsAg阳性,ΔA0.05时以实际OD值计算,见表2。
3 讨论3.1 分析和量化不确定度分量3.1.1 临界值CO的不确定度就是阴性对照平均值(NCx)的不确定度,NCx的不确定度主要由2个分量组成,即:由系统效应引起的阴性对照OD值NC的不确定度和由重复性试验(只有当阴性对照OD值NC大于0.05时)中随机效应rep引起的不确定度。
阴性对照NC代表的是阴性对照在某特定波长下的吸光度值,根据朗伯一比耳定律,吸光度值与吸光系数(a或ε)、液层厚度(b)和阴性样液浓度(C0)成正比,对于某一特定的显色反应来说,吸光系数是个常数。
乙肝表面抗原 酶联免疫法
乙肝表面抗原酶联免疫法乙肝表面抗原（HBsAg）酶联免疫法是一种常用的乙肝病毒感染检测方法。
乙肝是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的传染病，世界范围内乙肝病毒感染的人数众多。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白，也是乙肝病毒感染的最早出现的标志物。
通过检测乙肝表面抗原，可以及早发现乙肝病毒感染，对乙肝的预防和治疗具有重要意义。
乙肝表面抗原酶联免疫法（HBsAg-ELISA）是一种高灵敏度、高特异性的检测方法。
其基本原理是利用酶标技术，在固相载体上固定抗原抗体，将待测血清标本与之反应，然后加入酶标记的抗人免疫球蛋白，通过底物的反应产生颜色反应，最后通过酶标仪读取相应的吸光度值，根据吸光度值的大小可以判断是否存在乙肝表面抗原。
乙肝表面抗原酶联免疫法的操作步骤相对简单，操作方便，结果可靠。
首先，将标准品和待测血清标本加入孔板中，与固定的抗原抗体发生特异性反应。
然后，洗涤掉未结合的物质，加入酶标记的抗人免疫球蛋白，与乙肝表面抗原结合。
再次洗涤掉未结合的物质，加入底物，使底物发生酶促反应，产生可见的颜色反应。
最后，通过酶标仪读取吸光度值，根据吸光度值的大小判断是否存在乙肝表面抗原。
乙肝表面抗原酶联免疫法具有高灵敏度和高特异性的特点，可以检测到非常低浓度的乙肝表面抗原。
该方法的检测结果可靠，能够准确判断乙肝病毒感染的存在与否。
此外，乙肝表面抗原酶联免疫法还具有快速、经济、适用范围广等优点，因此在临床诊断和乙肝疫情监测中得到了广泛应用。
乙肝表面抗原酶联免疫法的应用不仅可以用于乙肝病毒感染的早期诊断，还可以用于乙肝病毒感染的筛查和追踪。
在乙肝疫情监测中，乙肝表面抗原酶联免疫法可以用于对高危人群的筛查，及早发现潜在的乙肝感染者。
此外，乙肝表面抗原酶联免疫法还可以用于评估乙肝疫苗的免疫效果，监测乙肝疫苗接种后的抗体水平。
乙肝表面抗原酶联免疫法是一种常用的乙肝病毒感染检测方法，具有高灵敏度、高特异性和可靠性的特点。
该方法的简便操作、快速结果和广泛应用使其成为乙肝病毒感染的重要检测手段。
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证摘要目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。
方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。
结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml，低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。
结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。
关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析方法学验证前言乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。
随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。
ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现报告如下。
1. 材料与方法1.1 试剂盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。
1.2 仪器酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。
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主讲人-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
✓ HBsAg酶联免疫分析试剂盒 ✓ HBsAg阳性品，阴性对照品 ✓ 移液枪，枪头 ✓ 湿盒 ✓ 酶标板，酶标仪 ✓ 一次性手套 ✓ 记号笔 ✓ 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放射性同位素： 酶：辣根过氧化物酶、 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄
125I、131I
碱性磷酸酶
绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹
明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
免疫酶测定法
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
上)，温育
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
•定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲 线计算样品抗原的浓度。
预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
1 23 4
阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
双抗体夹心法
间接法
5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：
清洗
清洗
清洗
用抗体包被固 相载体
加入抗原 Sample(二价以
• 1、 • 2、
课后问题
3、ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化；
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定；
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色。
ELISA的试剂
ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗 原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性） （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）样品及标准本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
2、ELISA基本原理
(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持 其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚 苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 (2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此 种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； (3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的 颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的 深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进 行定性或定量分析。